时间分辨荧光分析法（TRFIA）——划时代的检测技术

放射免疫分析（RIA），以其高度特异性灵敏度和实用性，吸引着各国的生物医学工作者，但操作中始终存在放射性污染、同位素半衰期短及试剂盒稳定性问题。为此，人们发展了一系列非放射性标记技术，如酶标记、化学发光、生物发光标记等技术，其中，时间分辨荧光免疫分析技术。由于灵敏度及线性范围明显优于其它技术，最为引人注目。

时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。普通的荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异，克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。

但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在，但是普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1－2ms，能够满足测量要求，因此产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法。

一、 时间分辨荧光分析法的优点

时间分辨荧光分析是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的超灵敏度检测技术，它克服了酶标记物的不稳定、化学发光仅能一次发光且易受环境干扰、电化学发光的非直接标记等缺点。使非特异性信号降低到可以忽略的程度，达到了极高的信噪比，从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度，且还具有标记物制备简便、对被标记物的生物活性和结构无影响、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、可实现 多种标记及多元测试、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点，成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑。

二、标记物

常用的标记物主要是Eu（铕）和Tb（铽）等镧系元素。其中，Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

由于常用Eu作为荧光标记，因此增强剂就成了试剂中的重要组成。增强剂原理：利用含络合剂、表面活性剂的溶液的亲水和亲脂性同时存在，使Eu在水中处于稳定状态。现在有些试剂，在络合Eu在抗体上时已考虑了增强问题，而使用了具有增强作用的新络合剂，因而有的试剂没有单独的增强剂。

三、检测原理

标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光谱峰范围窄，是类线光谱，这有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。激发光和发射光之间有一个较大的Stokes位移，有利于排除特异荧光的干扰，增强测量的特异性。标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。没一秒钟检测样品1000次，结果取平均值，有利于提高检测的准确性。

四、检测参数

灵敏度： 10-18 mol/well(Eu3+)

线性度： 10-18~10-12 mol/well(Eu3+)