靶细胞杀伤实验：总论

细胞介导的免疫反应（cell mediated immune， CMI）在机体抗感染及抗肿瘤免疫、移植排斥反应和自身免疫病中发挥重要的作用。CMI的主要效应细胞之一为细胞毒T淋细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。目前在医学基础与临床研究中重视CTL活性测定，将其作为了解机体细胞免疫功能和探索疾病机理的重要方法之一。

经文学事业上的资助者的CTL活性测定方法为51铬（Cr）释放法，本法结果准确、重复性好，但也存在以下不足：

1、使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测定仪器；

2、51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而影响结果判定；

3、51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验；

4、细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进行测定。因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素测定法。

一、荧光测定法

1、定法

（1）alamarBlue一步荧光测定法

alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。具体测定方法是：在靶细胞孔（T）、效应细胞孔（E）和实验孔（T+E）各加alamarBlue，共育6~24h后用板式荧光测定仪测530nm（发射）/590nm（散射）波长荧光强度，将T及E孔荧光均值相加后减去实验孔（T+E）荧光均值，与T孔荧光均值比较即可计算CTL对靶细胞的溶解%。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：

①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。

②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。

③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。

④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。

⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔即可）。

⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果。

（2）Calcein-AM荧光扫描测定法

Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂（一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。

即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。

2、流式细胞标记法

（1）PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法

正常细胞的磷酯酰丝氨（phosphatidylserine，PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早期事件，先于膜通透性增加所51Cr或其他染料的释放。

将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞百分数。

本法的优点

①简单快捷，无需预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；

②与51Cr法相关性好（r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力学分析；

③可允许E与T长时间共育，对探讨E通过合成及分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；

④可用荧光显微镜观察测定。

（2）DIOC18（3）/碘化丙锭（PI）荧光标记法

用DIOC18（3）（3，3，-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate）标记靶细胞膜，用红色荧光核染料PI（propidium iodide）标记效应细胞和死亡靶细胞，通过流式细胞分析可清楚区分2类细胞。

在用人和猪的外周血单核细胞（PBMC）作效应细胞时可观察到靶细胞溶解百分数与不同E：T比之间存在良好相关。本法简单易行，与51Cr释放法同样敏感可信，重复性和相关性很好，另一优点是可用新制备的脾细胞作靶细胞，不再需要培养及活化靶细胞，还可测多种动物的NK活性。

（3）PKH-26/CFSE荧光标记法

Sheehy等采用PKH26和CFSE双示法可有效地标记和区分靶细胞，其标记靶细胞后的自发释放仅为51Cr释放法的1/40，因此可更准确地评价及检测少量CTL介导的细胞溶解。平行试验结是显示本法与51Cr释放法明显相关（r2=0.998，p<0.0001），对进一步研究效应细胞溶解细胞的机理具有应用价值。

3、树突状细胞（DC）清除法

Ritchie等发现抗原标记的树突状细胞DC（dendritic cell）在体内的存活与CTL活性明显相关。

他们先将DC用两种不同荧光物质标记，再分为两部分，一部分用抗原标记，另一部分不标记，二者混合后注入小鼠皮下，发现只有标记了特异抗原的DC自引流淋巴结清除，未标记抗原的DC仍存于局部不受影响，改变注射部位及其他参数不影响本法测定结果。据此他们建立了这一简单灵敏体内测定CTL活性的方法。

由于DC可有效摄取及呈递复合抗原、核酸及凋亡小体，本法除可测定用特异性肽负荷的DC免疫或用流感病毒感染所产生的CTL反应外，也可用于评价不具有肽表位特征的抗原的CTL活性。

二、报告基因转染法

应用基因转染技术将原核或真核生物的报告酶如β-半孔糖苷酶（β­galactosidase，β­gal）或荧光素酶（luciferase，luc）基因转染靶细胞，建立稳定转染靶细胞系，以此测定CTL、NK细胞及药物介导的细胞毒和细胞凋亡。通过测定释放入培养液中报告酶活性（代表靶细胞死亡数目），可以计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。其中β­gal半衰期较luc长，应用较为方便。
本方法的优点：

1、灵敏度高，自发释放背景低；

2、用不同告基因转染的细胞系可同时测定杀伤活性，结果互不干扰，还可通过转基因小鼠进行在CTL活性研究；

3、用不同的基因调控元件（如组织特异性的或活性可诱导的启动子）控制报告基因的表达，可进一步深入进行机理研究。其主要不足是建立报告基因稳定转染细胞系费时费力rb告基因在有些靶细胞难以转染或表达。

三、比色测定法

1、MTT（或MTS）还原法

本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可计算效应细胞杀伤靶细胞百分数。本法简便易行，无需预标靶细胞，与51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定，其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假阳性结果。

2、LDH释放法

酸脱氢酶（LDH）在胞浆内含量丰富，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损伤或死亡时可释放到细胞外，此时细胞培养液中LDH活性与细胞死亡数目成正比，用比色法测定并与靶细胞对照孔LDH活性比较，可计算效应细胞对靶细胞的杀伤%。本法操作简便快捷，自然释放率低，可用于CTL及NK细胞活性测定及药物、化学物质或放射引起的细胞毒性，现已有LDH法测定CTL活性试剂盒（promega）。应注意较高浓度FCS中所含LDH可能干扰结果。

四、其他

1、“鸡尾酒“混合刺激法

Swincarski等介绍了一种测抗原特异性CTL活性方法，将外周血细胞在体外用一种含有抗原、细胞因子、共刺激分子及放射照射的饲养细胞的混合“鸡尾酒”刺激7天后，在有限稀释条件下可从微孔板快速测得抗原特异性信号。本法灵敏性高，较传统的CTL测定方法更有效，尤其是本法仅需150µl小鼠外周血而无需处死动物，因此可增加每次测定时的小鼠数量，还可在体内研究过程中于不同时间从每个小鼠多次取血测定，大大方便了CTL反应及其体内效果的相关性研究。

2、ELISPOT试验

酶联免疫斑点试验（ELISPOT）通过检测抗原诱导的细胞因子（如IFN-γ）的分泌，可在体外定量测定病人PBMC中抗原特异性T细胞反应（T细胞受抗原刺激产生并释放IFN-γ）。本法在肽特异性分泌IFN-γ的T细胞数量与细胞毒活性之间，与标准的51Cr释放法相关良好，是一种在临床试验中监测病人对肿瘤抗原的CTL或Th-细胞反应的灵敏、准确、价廉、的方法，可对肿瘤病人的抗肿瘤疫苗疗法的优化提供必要的信息。

以上几种CTL测定方法各有特点，其中随着荧光测定仪器的普及和新的荧光标记物的发现，荧光测定法将有可能取代传统的51Cr释放法，而微量和直接测定体内CTL活性的方法将为细胞免疫研究开辟新路。