蛋白酶PARP的测定检测细胞凋亡

蛋白酶PARP的测定检测细胞凋亡

聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶（PARP）为一种依赖Zn2+的真核DNA结合蛋白，可特异性地识别DNA断裂末端并结合， 是一种重要的DNA修复酶。在细胞凋亡发生的早期， PARP是caspase家族（如caspase3 和7）的作用底物，后者可使PARP的DNA 修复功能丧失。Caspase可将 113kD的PARP水解为89kD和24kD的两个片断。 本方法主要是运用抗PARP抗体，用蛋白印迹法（western blotting）检测PARP 89kD的裂解片断以及113kD完整的PARP蛋白， 以作为细胞凋亡早期的标志物。可检测3x105 凋亡细胞的PARP裂解片断。

【操作方法】

（1） 准备凋亡细胞的粗提物: 105 ~107 个细胞与尿素，2-巯基已醇（2-mercaptoethanol）和十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate， SDS）孵育或以超声波等方法诱导细胞凋亡后， 加入提取缓冲液，室温作用15分钟， 65℃15分钟；

（2） 从凋亡细胞粗提物中提取分离蛋白： 将凋亡细胞粗提物经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝焦电泳（SDS-PAGE）分离蛋白， 然后室温1小时用电印迹法（electroblotting）将所分离蛋白用醋酸纤维膜（nitrocellulose）或聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride， PVDF）膜上；

（3） 将转有凋亡细胞蛋白的膜以封闭缓冲液室温作用1小时，然后用抗-PARP抗体（1：200）室温下与膜孵育2小时。 以封闭缓冲液室温洗涤二次， 每次25min；

（4） 观察抗体-蛋白复合物与酶联的抗-IgG二抗和化学显色或化学发光（chemiluminescent）酶底物在膜上反应的条带。

【结果判断】

显色反应的强弱与膜上条带PARP含量成正比