酵母表达系统

基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。

1、酵母表达系统的特点

酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。

酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。

解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统)

（1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统

酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。

酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制 ，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。

为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。

（2）甲醇营养型酵母表达系统

甲醇营养型酵母包括汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)等。

AOX1的甲醇诱导表达量可占胞内总蛋白质的20％~30％，表明AOX1的合成受转录水平的调控。AOX1启动子(PAox )具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。

甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用，它由野生型石油酵母Y11430突变 而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和 MC1o0-3。GS115和KM71是Y1 1430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，h/s4)缺失突变体，不能合成 H/s4，因此质粒载体需携带h/s4，转染后的阳性重组子可以用h/s4缺陷 (h/s4-)平板进行筛选，但是GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为h/s正常菌株，致使h/s4’平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。

GS115的启动子为P，在含甲醇的培养基中可以快速生长。KM71的启动子为P，除了h/s4-外，其精氨酰琥珀酸裂解酶基因(argininosuccinate lyase gene，arg4)也被缺失突变，不能在缺乏Arg的培养基上生长。

KM71的基因型为h/s4 argaox1：：ARG4，由于野生型ARC．4基因插入截断了OX1，KM71只有依赖较弱的AOX2基因进行甲醇代谢，生长速度较为缓慢。MCIO0-3的两个AOX基因都被剔除，其基因型为 his4 arg4 aox1：：SARG4OX2：：Phis4，完全不能在含甲醇的培养基上生长。

最近，人们新推出了一类蛋白酶缺失型菌株，如SMD1163(his4 pep4 prb1)、SMD1165(his4 prb1)和SMD1168(his4 pep4)，解决了降解所造成的表达产物不均一性问题。但是，蛋白酶缺失型菌株生长缓慢，导致外源蛋白质产量上不去。

巴斯德毕赤酵母包括自我复制型游离载体和整合型载体，前者极不稳定，因此一般采用整合型载体。整合型载体含有一个启动子、相应的转录终止密码、筛选标记、抗生素抗性基因、在细菌中进行拷贝增殖所必需的序列以及3 ‘AOX1非编码区序列P。是已知最强的启动子，它可以使外源蛋白质的表达量达到宿主菌总蛋白的5％~40％。另外某些整合型载体还含有外分泌信号肽，表达产物可以被分泌到培养基中，利于纯化处理；对于C末端带多聚组氨酸(6×His)的整合型载体，可以用树脂纯化表达蛋白质。常见整合型载体如pPIC3KPIC9K、pPICZ、pAO815、pPICZ和 pGAPz。 构建好的巴斯德毕赤酵母表达载体被相应的内酶消化 变成线状，用电穿孔法、LiC1-PEG法或原生质体法将线性化载体转化到宿主菌中。线性化的置不同使载体有两种方式与宿主菌染色体整合。当消化载体产生的DNA片段与5’AOX1和AOX1两端同源时，线性化载体DNA可以直接替基因组AOX1，即发生了单位点置换，产生Mut表型的阳性重组菌株；当酶切位点发生在AOX1的5’端或HIS4标记内时，线性化载体DNA将在基因组的同源位点发生整合，Mut+表型由宿主菌决定。

巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等其与糖基化位点其他哺乳动物细胞相同，为Asn-XSer／Thr，生成的糖链较短，一般只有8~14个甘露糖残基，核心寡聚糖链上无末端，3甘露醇，抗原性较低，特别适合于生产医药用重组蛋白质。

（3）裂殖酵母(Schizogenesis pombe)表达系统

裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。

3、利用酵母菌表达外源基因的步骤

以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例，包括如下步骤：将目的基因克隆入毕赤酵母表达载体，收获阳性重组表达质粒一用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒，使之线性化一将线性化的阳性重组质粒转化人巴斯德毕赤酵母菌株(如GS1 15，KM71)一将转化物接种HIS4缺陷平板进行第一轮筛选一用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选一挑选10~20个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量一挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因的表达蛋白质。

4、在酵母表达载体中高效表达外源基因的策略

（1）增加整合在酵母染色体上的目的基因剂量

适当增加目的基因整合到酵母染色体上的拷贝数(即基因剂量)是有效提高外源基因表达量的基本策略。Clare等在利用毕赤酵母表达破伤风毒素片段时发现，重组蛋白质的表达量与外源基因片段表达单元整合到酵母染色体上的拷贝数直接相关。表达单元拷贝数越多，酵母分泌的重组蛋白质量越高。Vassi|eva等叫在利用毕赤酵母研究乙肝表面抗原的表达时报道，基因剂量与表达水平呈明显的依赖性关系，4个拷贝的基因剂量可以使表达水平提高4倍。Zhu等报道24个拷贝的M-CPTY的表达量是单拷贝的10倍。但是，整合过多的外源基因拷贝数将导致重组DNA的不稳定。

（2）控制外源基因中的AT含量

研究发现外源基因的AT含量直接影响其整合表达。Score等在研究HIV-1外壳蛋白的酵母表达时发现，A含量过高可以提前终止转录，得不到全长蛋白质产物，用人工合成具有较高 GC含量的cDNA进行表达，才得到了全长蛋白质表达产物，与Macreadi等的报道相似。

（3）选择最为合适的信号肽 

酵母表达外源蛋白质可以是胞内的，也可以是分泌到胞外的，分泌到胞外对外源蛋白质本身而言更稳定，产量也较胞内形式更高，因此人们多选择分泌型的表达菌株，但是信号肽具有选择性，所以选择合适的信号肽对于提高某种重组蛋白质的表达量是非常重要的。Koganesawa等在研究毕赤酵母表达系统的分泌信号肽时发现：使用OL信号肽时，人溶解酵素的表达量明显高于家蚕溶解酵素的表达量，且家蚕溶解酵素的表达产物性质不稳定，收获表达蛋白质的肽链长短不齐，出现明显的不均一现象；使用它们各自的天然信号肽时，家蚕溶解酵素的分泌水平明显高于人溶解酵素的分泌水平。Maainez-Ruiz等发现标准的分泌信号肽OL-MF和PHO1在某些外源基因表达中失灵，于是开始了合成分泌信号肽的研究。他们构建核糖体失活蛋白K(ribosome．inactivatioprotein K)的天然信号肽突变体，终使表达成 功。Kjeldsen等在研究人胰岛素表达时，人工设计并合成了一个完全的合成分泌信号肽，结果使人胰岛素的表达量大大提高。

（4）其他 

外源基因在酵母菌表达的影响因素还有很多，如整合位点、mRNA 5和3非翻译区(UTR)、宿主菌的Mut表型、蛋白酶、表达 蛋白质自身的特点、培养基及培养的环境条件等，有效控制各种影响表达的因素，对于外源基因的高效表达都是必不可少的。

5、说明

鉴于甲醇酵母在当前的广泛应用以及相对于其他酵母表达系统所具有的优点，因此本篇中主要以介绍甲醇酵母为主。