组织Caspase-3活性测定操作规程
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一、原理与意义
该方法通过比色法测定p硝基苯胺（pNA）含量，它来自于Ac-DEVD-pNA与Caspase-3（CPP 32）的反应产物，因为游离的pNA显黄色，在405 nm下有吸收峰。最后，根据处理组与空白对照组的倍增关系来反应组织Caspase-3活性的高低。Caspase-3在哺乳动物体内启动细胞凋亡过程，根据组织Caspase-3活性的高低可在一定程度上反映处理因素有无诱发体内细胞凋亡。
二、试剂组成与配制
1、反应缓冲液（PH 7.5）：100 mM Hepes 缓冲液、20%甘油、0.5 mM EDTA、5 mM DTT，用NaOH调PH值，加双蒸水定量。4 ℃保存。
2、裂解缓冲液（PH 7.5）：100 mM Hepes 缓冲液、20%甘油、0.5 mM EDTA、5 mM DTT、0.2%SDS。常温保存。
3、底物（Ac-DEVD-pNA）：用DMSO配成终浓度为1 mM。-20 ℃保存。
4、抑制剂（Ac-DEVD-CHO）：用DMSO配成终浓度为10 mM贮存，用时再稀释到0.1 uM。-20 ℃保存。
5、标准（pNA）：用无水乙醇配成30 mg/ml，即217 mM。4 ℃保存。
三、实验器材
37 ℃水浴锅、离心机、405 nm分光计、制冰机、加样器、1.5/2 ml离心管和管架等。
四、操作步骤
1、组织匀浆：肝脏组织用裂解缓冲液按10%匀浆。
2、裂解与离心：匀浆冰浴裂解30 min，然后12000 undefined20 min，吸取上清。
3、上清蛋白测定：用Lowry法测定上清蛋白含量。
4、加样及反应：加样后水浴37 ℃×1 h。
| 组别 | 反应缓冲液（ul） | 样品（ul） | 双蒸水（ul） | Ac-DEVD-CHO（ul） | Ac-DEVD-pNA（ul） |
| 测定管 | 240 | 30 | 0 | 0 | 30 |
| 对照管 | 240 | 30 | 30 | 0 | 0 |
| 加抑制剂 | 240 | 30 | 0 | 0.3 | 3undefined |
5、水浴1 h后，迅速插入冰中，以终止反应。
6、比色法测定：加900 ul双蒸水稀释后12000 r×20 min，以蒸馏水调零，取上清在405 nm下比色。
7、结果计算： 用公式计算底物浓度Y（uM）=112.84×OD405-0.8114（R2=0.9988）。
五、标准曲线制备
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 吸光值 | 1.192 | 0.631 | 0.326 | 0.163 | 0.077 | 0.038 | 0.017 | 0.008 | 0 |
| 标准浓度（uM） | 135.625 | 67.812 | 33.906 | 16.953 | 8.4766 | 4.2383 | 2.1191 | 1.0596 | 0 |
六、注意事项
1、组织匀浆要充分裂解，适当延长冰浴裂解时间。
2、反应缓冲液和裂解缓冲液用PH计调PH值至7.4~7.5。
3、加样时尽量在冰上进行，以免底物加入后，反应提前进行。
4、底物与标准对光敏感，应避光贮存。
5、若结果用具体数值表示，建议蛋白定量后测定组织Caspase-3活性。
[1] Kwon SH, Ahn SH, Kim YK, Bae GU, Yoon JW, Hong S, Lee HY, Lee YW, Lee HW, Han JW. Apicidin, a Histone Deacetylase Inhibitor, Induces Apoptosis and Fas/Fas Ligand Expression in Human Acute Promyelocytic Leukemia Cells. J Biol Chem., 2002； 277： 2073-2080.
