Caspase-3 活性的检测
最新修订时间：
原理
Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用， 其中caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。
材料与仪器
步骤
一、Western blot 分析Procaspase-3 的活化，以及活化的Caspase-3 及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：收集细胞→PBS 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 电泳→硝酸纤维素膜或PVDF 膜转移→5 %脱脂奶粉封闭，室温1.5~2 h 或4 °C 过夜→Caspase-3 多抗或单抗室温反应1~2 h 或4 °C 过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3 次，5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG 或AP 标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2 h→ TBS-T 洗3 次， 5~10 min/次→ECL 显影或NBT/BCIP 显色。
二、荧光分光光度计分析
1. 原理：活化的Caspase-3 能够特异切割D1E2V3D4-X 底物，水解D4-X 肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的AMC 荧光强度的大小，可以测定caspase-3 的活性，从而反映Caspase-3 被活化的程度。
2. 方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS 洗涤，制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽荧光底物），37 °C 反应1 h，荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380 nm，发射光波长为430-460 nm）。
三、流式细胞术分析
方法：收获细胞正常或凋亡细胞，PBS 洗涤，加Ac-DEVD-AMC 37 °C 反应1 hUV 流式细胞计分析caspase-3 阳性细胞数和平均荧光强度。
来源：丁香实验
