聚蔗糖泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

（1） 聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。

（2） 台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。

（3） HBSS或RPMI-1640液

【操作方法】

（1） 采集静脉血若干ml(随需要而定),注入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125～250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；

（2） 用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；

（3） 吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45°角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；

（4） 将离心管置水平式离心机内,在18℃～20℃下,以2，000r/min离心20min。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图1。

Ficoll-Hypaque离心法分离血液成分

（5） 用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞,盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分；

（6） 将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次,依次以2，000r/min、1500r/min在室温下(18～25℃)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板；

（7） 用完全RPMI-1640定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每ml健康成人血可分离出1×106 ～2×106 个单个核细胞；

（8） 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2％台盼蓝染液,5～10min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,一般活性应在95％以上。

【注意事项】

（1） 与血液样品接触时应注意生物安全防护,避免血源性传染病。

（2） 操作应轻柔,细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。

（3） 细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为1.077±0.001g/L;应避光4℃下保存,取出后逐渐升至室温后混匀,方可使用;使用中应避免细菌污染。

（4） 稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量,但如果要保留血浆成分作其它实验用时,则不能稀释血液,以免影响血浆成分。

（5） 离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高,增加红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为18～20℃。

（6） 若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块,然后再按上述方法分离。

（7） 分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法