毛细管电泳与质谱联用技术

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是80年代初发展起来的一种基于待分离物组份间淌度和分配行为差异而实现分离的电泳新技术。具有快速、高效、分辨率高、重复性好、易于自动化等优点。质谱分析技术（MS）是通过对样品离子的质量和强度的测定进行定量和结构分析的一种分析方法。具有分析灵敏度高、速度快等优点。这两种技术的联用（CE/MS）综合二者优点成为分析生物大分子物质的有力工具。本文对近年来CE/MS中的接口及样品预浓缩技术作一综述。

1 仪器结构

任何一种类型质谱仪诸如傅立叶变换离子回旋加速共振质谱（FT-ICR） 、飞行时间质谱、离子陷阱质谱和三级四极杆质谱等均可与CE联用，但四极杆质谱与CE联用最常见。在各种CE与质谱联用中，区带毛细管电泳（CZE）最常用。

其它如毛细管等电聚焦电泳、胶束电动毛细管色谱、毛细管凝胶电泳、毛细管等速电泳等应用较少。电子喷雾离子化（Electro-sprayIonization，ESl）是质谱首选的离子源。其理由有二：ESI可用于检测多种高质量的带电分子；其次，从CE分离出来的分子经过接口可以直接进入质谱仪。

2 接口技术

CE末端接口是影响整个检测的一个关键因素，所有CE/ESI-MS接口的目标都是为了获得稳定的雾流（Spray-Current）和高效的离子化。

由于CE需要较高离子强度、挥发性低的缓冲液，而ESI需要相对较低的盐浓度才能获得好的雾化及离子化。因此接口技术必须优化，使其尽可能提供好的电子接触，同时尽量减少对CE分离效率的影响。此外，对于每一种接口应选择相应的缓冲液。CE/ESI-MS接口共有三种类型：同轴液体鞘流（Coaxial Liquid Sheath Flow）、无鞘接口、液体连接。

2.1 同轴液体鞘流

此种类型接口是最常见的连接CE与ESI-MS的方法。该接口是一个同心的不锈钢毛细管套在电泳毛细管末端，鞘内充有鞘液。再在此不锈钢套外再套一个同心的钢套，鞘内通鞘气。鞘液与毛细管电泳缓冲液液体在尖端混合，同时被鞘气雾化。鞘液流量通常为每分钟纳升至数微升之间，但却显著高于CE流速。

由于鞘液的稀释作用，雾流稳定性得到改善。理想的鞘液缓冲液盐浓度应在高分离（高盐浓度）和高雾化（低盐浓度）间优化。由于鞘液在雾化过程中也完全蒸发，鞘液的稀释并不显著降低检测灵敏度。但混合液体的体积应尽可能小，以避免谱带展宽。

2.2 无鞘接口

该CE末端做成尖细状以获得稳定的电子雾化。该末端外套一同心套管，内通鞘气。该接口难点是不易同时保持CE和ESI的电路循环。为此，在毛细管末端粘上金丝或镀一层金，但因为金的粘着力差，易被机械的或电子的原因除掉，因而接口性能差且寿命短。近来有人改进了这一接口。他们首先在CE末端镀上一层镍或镍/铬合金，再镀上金，使接口寿命超过100小时。另外有人用铂或镀金不锈钢丝插入CE末端作为毛细管内电极，并以对苯二酚缓冲液为添加剂以抑制电化学反应产生的气泡。此种接口相对于同轴液体鞘流接口，待分析物未被稀释，检测灵敏度要好一些，尤其是与微克级或纳克级电子雾化源相连时。

2.3 液体连接

该接口为CE末端与一个直径10～20μm的槽垂直相连，槽内充有CE缓冲液。与CE末端相对的槽的另一端接上ESI。此装置优点在于可通过任意调节槽内液体流速以改善ESI效果，然而这通常是以谱带展宽和分离效能减低为代价取得的。此外，该装置技术难度较大，现仅见于芯片CE与MS联用的仪器。

3 样品预浓缩

CE由于受进样量限制，对一些含量较低的物质检测其灵敏度仍显不足。因此有必要对样品在分离前进行预浓缩。浓缩的方式有三种：在线（On-Line）预浓缩、线内（In-Line）预浓缩、线外（Off-Line）预浓缩。依据浓缩原理有两类：基于电泳的预浓缩，主要有样品堆积（Sample Stacking） 、场放大进样（Field-Amplified Injection，FAI）、等速电泳进样（Isotachophoresis，ITP）等；另一类是基于层析原理的预浓缩，主要有固相吸附层析、液相分配层析、中空纤维层析、免疫亲和层析等。

3.1 样品堆积

该技术是根据样品塞子与电泳缓冲液导电性差异实现的。若样品的导电性小于缓冲液，样品塞子上的电场强度将相对高于缓冲液，样品塞子中离子的迁移速度将大于CZE缓冲液 ；若样品以“夹心饼干”方式进行CZE，则待分析物在电泳缓冲液中聚集浓缩。此技术可显著增加样品的输出信号，约达20倍。

3.2 FAI

FAI类似于样品堆积，也是根据分析物的迁移速度与电泳缓冲液间的差异实现的。唯一差别在于进样步骤和聚集过程。FAI是在整个进样过程都施加电压，而聚集发生在用缓冲液更换样品瓶直到CZE开始的一段时间。此技术可突破样品堆积技术70%毛细管体积进样量限制，可使样品浓缩约100倍，但有进样岐化现象。

3.3 ITP

ITP既是CE的一种电泳模式又可作为预浓缩的一种方法。用ITP进行预浓缩有两种模式：cITP（Coupled-Capillary ITP）和tITP（Transient-ITP）。cITP是用两根毛细管联结起来，一根用作ITP，另一根用作CZE。cITP仅用于水溶性样品且装置复杂因而并不常用。tITP是一种线内方法，它用同一根毛细管既作ITP又作CZE。tITP包括两个步骤：第一步，待分析物溶解于前导离子（LE）中（通常是氨溶液），以动力进样方式将样品导入毛细管中。随后将毛细管插入尾随电解质（TE）瓶中（通常为醋酸），施加一个大约30KV电压在毛细管两端，使LE、待分析物、TE向阴极移动，由于淌度的差别，待分析物被聚集在LE和和TE之间；第二步，用LE作为背景电解质（Background Electrolyte）进行CZE。此技术对蛋白质和阴、阳离子多肽均可进行分析，极具前景。

3.4 固相吸附层析

该技术有两种方式：固相萃取（SPE）和膜预浓缩。SPE常用C2、C8 或C18作吸附剂，萃取床连接在转移毛细管与CZE之间。样品通过转移毛细管进入萃取床，以电泳缓冲液冲洗样品，随后注入50～100nl有机修饰剂的塞子使样品洗脱进入CZE系统，随后进行CZE。有机修饰剂可引起样品堆积。此法可显著降低检测限浓度，但使分离度减小、谱带展宽和出现拖尾。为减少此类影响有人用Cg膜作吸附剂，进一步减少萃取床体积，取得很好效果。

3.5 液液分配层析

液液分配层析预浓缩有两种技术：EE和SLM。EE是根据液液分配层析和电泳而实现的。它有三个步骤：第一步，将样品溶解在非极性溶剂中（如乙酸乙酯），再将装有LE的毛细管进样端插入样品瓶，以电动方式进样，同时由于液体对流的作用，可避免大量的乙酸乙酯进入区带毛细管；第二步，毛细管插入尾随离子（TE）中，在电场作用下，开始发生聚集。到达稳态后，毛细管插入LE瓶中进行CZE。此法浓缩能力高达1000倍，但蛋白质容易变性和在非极性相中沉淀。SLM是一种线外预浓缩技术，它用一张浸有非极性溶剂（如十一碳烷）的聚丙烯膜，将预浓缩室隔成两个部分，一部分为供相，为样品进入相；另一部分为受相，作为富集相。两相均为水溶性。通过调节二相pH，使分析物在供相中不带电荷，进入受相则带电荷，从而达到浓缩目的。例如对一个碱性离子化合物的浓缩，调节供相pH，使pH高达10～12，而受相pH很低（例如2～4），因而碱性离子极易以中性分子的形式透过液膜进入受相，而不易从受相扩散进入供相。

3.6 中空纤维

利用中空纤维壁能够选择性阻止一定分子量的物质通过的特性而达到浓缩目的。此技术将中空纤维通过Teflon管与毛细管相连接，并以电动方式进样。由于蛋白质不能透过中空纤维壁而聚集在毛细管入口端，浓缩完成后，关掉进样电场，接通分离电场进行CZE。该技术是在线方式，不但快速、浓缩效率高，而且可除掉一些小分子物质，如盐类。对痕量蛋白质的检测十分有效。

3.7 免疫亲和层析

该技术将亲和层析柱与毛细管直接相连，以加压方式进样，然后依据待分析物的性质，以小体积的有机溶剂或特殊缓冲液进行洗脱，进入CZE系统，该法进样量可达50μl，浓缩高达100～500倍，因此有效地降低了检测限浓度。

4 存在的问题与展望

CE/MS联用技术大大拓宽了CE和MS本身的应用领域，但CE固有的缺陷并未克服。在DNA分离时，极高的电场强度容易使较长的DNA发生伸展改变，呈杆棒状，降低分离效果。现有的三种类型接口均有不同程度的缺陷。如同轴液体鞘流接口，由于鞘液对CE流出物的稀释作用而降低检测灵敏度，鞘液的成分和浓度对CE的分离均有影响；而无鞘接口寿命太短；液体连接接口同样存在谱带展宽的缺陷。从现有的应用及发展趋势看，随着接口技术的不断改进，芯片CE与MS联用技术的完善，一些新的浓缩技术（例如分子印迹）等的应用，CE/MS在蛋白质组学、化学药物研究、临床实验诊断以及法医学等领域均已显示了广阔的前景，正成为分析工作者的重要工具之一。