膜蛋白分离方法

一、简介：

1 细胞质膜资料

1895 年 ,Overton 从研究细胞透性得出 " 细胞膜由连续的脂类物质组成 " 。

1925 年 Gorter&Grendel: 用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出： " 细胞膜是由双层脂分子组成 " 。

1935 年 Danielli&Davson ：从测定膜的表面张力得出细胞膜的 " 三明治结构模型 " ，即蛋白质－脂 - 蛋白质。

1959 年 Robertson: 用电镜观察生物膜提出 " 单位膜模型 " ，将膜的分子结构与超微机构统一起来

厚度： 2( 暗 ) 3.5( 亮 ) 2 （暗） =7.5

细胞质膜的主要功能概括如下：

(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境 ;

(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；

(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；

(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；

(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接 ;

质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2 膜蛋白

虽动物细胞主要有 9 种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1) 外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent) 使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至 proein microarray 都还不能有效解决这一问题。

二、蛋白抽提

谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法……有时这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的蛋白质由于结构和组成的差异，其溶解度也各不相同 . 根据蛋白质的溶解特性，同时可选择不同的溶剂提取，分为水溶液提取和有机溶剂提取 .

但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐， CHAPS( 一种离子去污剂）， Emulgen 和 Lubrol 等表面活性剂。

1 、分离膜蛋白的方法（原则性）：

1 ） 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。（例如： michael11 液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速离心。蔗糖密度梯度离心。收集 37% 与 41% 间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋白 ）

2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难 . 在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定 . 去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤 . 虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂 .

这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题 . 如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠 . 许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂 . 然而，他们并不是普遍适用的 . 在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质 . 如 triton X-100 在 280nm 处有吸收，如果某蛋白质的测试与 280nm 处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂 .

将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来 . 这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入 . 使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ <5000Da ）要多 .

一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足 0.1% ，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的 . 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用 4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX114 水溶液，在温度超过 20 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。

3 ) 膜蛋白色谱 (Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP 分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如 SDS ）溶解膜蛋白后形成 SDS- 融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（ P- 端），又具有阳离子钙（ C- 端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、 SDS 结合量有关。利用原子散射法研究 cAMP 的分离机制发现，样品与 SDS 结合后在离子交换柱上存在 SDS 分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。

4) 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用 Tris 碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的 pellet 用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。

5)centrifugal protein extraction

原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心

评价：尽管分级 ( 胞浆和胞膜 ) 之间有清洗的步骤 , 但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间仍然有不少重复的点 . 该方法相较 MOLLOY MP 教授在 1998 年 electrophoresis 上发表的分级抽提法减去了第一步 ( 用 tris 抽提水溶性蛋白 ) 和最后一步 ( 极难溶蛋白 ), 在操作上也作了简化 , 总而言之是一种不错的方法。（ codegreen ）

6)detergent- based ：提取时先裂解液裂胞膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度离心分离细胞器 (ER) ，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的 DEBRIS 就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部分。

总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方法有双向免疫扩散、免疫电泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用双缩脲法、酚试剂法或紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。

到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。

2 、分离膜蛋白的方法（操作）

1）分离细胞膜蛋白的方法：

1、冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 A 中，于室温与液氮罐中反复冻融 2 次。

2、5000 转 4 度离心，驱除核及未裂解的细胞。

3、取上清 12000 转 4 度离心 10 分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 B 中。

4、12000 转 4 度离心 10 分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液 C 中提取后测蛋白浓度 ,SDS-PAGE 电泳，分装后 -20 度保存备用。

buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)

buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA

buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),

2 ）分离细胞膜蛋白的方法：

1 、细胞放在冰上，去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

2 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min

3 、刮下单层细胞， 4 度下 10 000g 5min 离心

4 、溶液 37 度水浴 10min 以分离水相和去污剂相，然后 37 度下 2 000g 离心 5min

5 、收集水相留作分析

6 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴 2min 后加温，在按步骤 6 再次离心

7 、按步骤 8 再次抽提去污剂相，用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

8 、用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1 、 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制剂

2 、缓冲液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）

3 、 buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

3 ）分离细胞膜蛋白的方法：

7M urea

2M thiourea

4%chaps

2.5%sb3-10

1000000 个细胞，可用此 buffer 1ml 。 冰浴匀浆。冰上置 30 分钟。

4 度高速低温离心 30min 。

取上清 -20 保存。

4 ）分离组织膜蛋白的方法：

1 、取组织，加入 10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2 、 J6-HC 离心机 800rpm ， 4 ℃离心 10min 后，所得上清液转入超速离心管。

3 、 100000g ， 4 ℃离心 1hr 。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B 重悬，冰上孵育 2hr 后分装至 EP 管， Eppendorf 台式离心机 10000rpm ， 4 ℃离心 30min 。

4 、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A ： 0.32M 蔗糖， 5mM Tris-HCl （ PH 7.5 ）， 120mM KCl ， 1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。冰上预冷。

Buffer B ： 20mM HEPES （ PH 7.5 ）， 10% 甘油， 2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin 。 冰上预冷。

5 ）分离组织膜蛋白的方法：

RIPA

1XPBS

1%NP40

0.5 去氧胆酸钠

0.1%SDS

以下用时加入

10mg/ml PMSF 异丙醇（终浓度 10ul/ml ）

Aprotinin （ 30ul/ml ）

1000mM Sodium Orthovandate （ 10ul/ml ）

冰冻组织 100mg/ 细胞 1000000 个，可用 RIPA buffer 1ml 。 冰浴匀浆。冰上置 30 分钟。

4 度高速离心 30min ， 20000 转低温离心最佳。

取上清 -20 保存。

6 ）分离细菌膜蛋白的方法：

1、于 20ml 营养肉汤中过夜培养细菌， 37 ℃， 200rpm 。

2、10000g 、 20min 、 4 ℃离心，去上清。

3、20ml 预冷的 Tris-Mg 缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的 Tris-Mg 缓冲液。

④ 超声波破碎细菌。

⑤ 3000g ， 10min 、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。

⑥ 超速离心 I ： 100,000g ， 60min ， 4 ℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。

⑦ 用 10ml 含 2 ％的 SLS 的 Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育 20-30min 。

⑧ 超速离心 II ： 70,000g ， 60min ，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。

⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用 0.1-0.2 ml 的 ddH2O 重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度 (mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260 测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至 40ug/ul ，该蛋白质样品 -70 ℃贮存。

试剂

① Tris-Mg 缓冲液

10mM Tris-Cl

5mM MgCl2

pH 7.3 ， 4 ℃保存

② 2%(w/v) 十二烷基肌氨酸钠 (SLS)

7 ）来源于 Methods Enzymology (1974)

1、 取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加 40ml 介质。

2 、用 Potter-Elvehiem 匀浆器，杆与壁间间隙 0.5 ～ 0.6 μ m,14.4kr/min 上下匀浆 4 ～ 6 次，每次 5S 。

3、过滤匀浆液， 150g 离心 10min ，保留上清，沉淀部分加入 50 μ l 介质，用匀浆器 1kr/min 匀浆 3 次， 150g 离心 10min ，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。

4、合并 3 次上清液， 2kg 离心 10min ，弃上清，沉淀部分溶于 100 μ l 介质，离心 10min ，弃上清，留沉淀。

5、将沉淀部分加入 70% 蔗糖 15 份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加 54% 、 49% 、 45% ， 41% ， 37% 蔗糖溶液各 2 、 2 、 5 、 5 、 3 份。

6、 700kg 离心 90min ，分离介质在 1.16 ～ 1.18 之间形成介面。

7、收集 d 为 1.16 ～ 1.18g/ml 之间的细胞膜，加 30 倍的介质以 2.5kg 离心 10min ，洗涤 2 次。

8、保存于 2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5 缓冲液中，用于细胞膜的研究分析

8 ）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在 4 摄氏度下进行）

1. 在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成 1mm3 大小的碎片，且无可见的血。

2. 加入 5 倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的 Dounce 氏玻璃匀浆器中，抽研 10-20 次，匀浆组织。

3. 匀浆 4 摄氏度 600g 离心 10min ，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。

4. 上清 4 摄氏度 8000g 离心 10min ，沉淀线粒体。弃沉淀。

5. 上清 4 摄氏度 10000g 离心 20min ，弃上清。

6. 用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次 4 摄氏度， 10000g 离心 20min ，弃上清。

7. 用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。

8. 粗制的样品可于干冰 / 乙醇中速冻，保存于 -80 摄氏度。

9 ）用特殊的去污剂选择性的分离。

简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

原理： 4 度时所有的蛋白质原则上都溶于 TritonX114 水溶液，但在 37 度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。

方案

1 、放射性标记受试细胞

2 、将标记的细胞放在冰上

3 、去除上清，用 pH7 。 4 的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

4 、加入 1ml2%TritonX 溶液冰浴 15min

5 、刮下单层细胞， 4 度下 10 000g 5min 离心

6 、溶液 37 度水浴 10min 以分离水相和去污剂相，然后 37 度下 2 000g 离心 5min

7 、收集水相留作分析

8 、用 500ul 冰冷的 buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴 2min 后加温，在按步骤 6 再次离心

9 、按步骤 8 再次抽提去污剂相，用 buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

10 、用等量的 buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验

试剂：

1 ） 2%tritonX114:2%TritonX114 、 50mmol/L Tris HCl （ pH7 。 5 ）、蛋白酶抑制剂

2 ）缓冲液 A （含 0 。 5mol/LNaCl 的 RIPA buffer ）

3 ） buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5)

150mmol/L NaCl

5mmol/L EDTA(PH7.5)

10 ）植物中：高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方法也很多，植物材料中以

1、蔗糖密度梯度离心、

2、水溶性双水相法、

3、自由流电泳等方法为主。