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腺病毒转染神经元,转进去GFP的神经元全部死亡,什么原因?

互联网

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xunmixm问:

请教有经验的网友们,我利用重组后的腺病毒感染原代培养的小脑颗粒神经元,转染率在5%左右,但是发现凡是转染进去GFP的神经元全部死亡,(而转进GFP的杂质细胞-如胶质细胞状态良好),神经元表面好像桑葚状,感觉要碎掉了,有的漂起来,看不到有GFP标记的神经轴突。

请教如下问题:

1.造成上述神经元死亡的原因是什么呢?

2.如何提高腺病毒的转染率?可能我的病毒滴度还不够高。我的操作是腺病毒和神经元共同孵育1h(使用刚盖过细胞的最小体积培养基),然后补加培养基到正常培养体积。请问,在腺病毒滴度一定的条件下,怎样的转染操作能使转染率提高?转染后,是否应该换新液,将腺病毒除掉?

丁香园网友 kangdejiao 认为:

一般腺病毒载体和腺病毒毒液是完全不同的概念

腺病毒载体转染细胞后包装出来的是腺病毒毒液,然后用毒液去感染你的细胞.

请问你的病毒是带EGF的空病毒载体吗,看了你的图片很正常,一般腺病毒的感染效率是百分百的,或者不感染,腺病毒感染不了神经细胞,淋巴细胞,(你的带荧光的细胞好象是胶质细胞,个人觉得)

腺病毒本来就对细胞有一定的毒性,如果感染后出现在一定的时间出现大片的死亡,说明你的病毒载体里带有制毒基因,还有这和你的病毒滴度,感染时间有很大关系

我用病毒感染过胶质细胞,带荧光的,图片很美。

丁香园网友 xunmixm 反馈:

感谢kangdejiao的回复,我的表达不够准确,我是利用你提到的“腺病毒毒液”感染神经元的,谢谢指正!

我的病毒是带hrGFP的,和EGFP类似。我做的过表达载体,利用带hrGFP的空载体作为对照,奇怪的是,就连空载体(只表达hrGFP)的腺病毒感染的神经元都死掉了,这是为什么呢?

想请教一下,腺病毒可以感染神经细胞的吧,文献中有报道啊,针对我使用的的颗粒神经元进行腺病毒感染的文献在pubmed上也可以查到。你的意思是说腺病毒对神经细胞感染效率低吗?

丁香园网友 kangdejiao 认为:

如果你的荧光不是很强,只能说明你的病毒滴度不是很高。

请问你感染细胞的滴度是多少,时间很重要,如果是滴度很高,可以在24H内可表达,细胞可出现死亡。

腺病毒对细胞的感染效率不可能低,只能是可不可以感染的问题。

丁香园网友 xunmixm 反馈:

实际上,我还没有测定滴度,想先看看收取的腺病毒到底能不能感染自己培养的神经元,以及大致估计一下现在的滴度有多高。我是把从一个10cm皿收集到的病毒(最初293贴壁率90-95%,收病毒时,细胞基本都变圆,>;70%细胞漂起来-是不是有点收晚了? 细胞经过4次冻融后离心,病毒收集到0.5ml PBS中)平均分散到6孔板的7-8个孔中感染,得到的感染效率大概在1-5%之间。

1.我现在最糊涂的问题是搞不明白,为什么感染对照组腺病毒的神经元(只表达hrGFP)也会死掉?

2.如何提高感染效率?请问,10个10cm大皿收集到的病毒溶解在1ml PBS中,得到的病毒滴度大概有多少pfu/ml?

如果想得到>;50%的感染效率,收集到的腺病毒一定要经过CsCl密度梯度离心进行纯化吗(担心损失病毒,也担心染菌)?

丁香园网友 kangdejiao 认为:

很可能是你的病毒毒粒很少.在你扩增病毒时,你用原始的病毒感染293时,看到的荧光多吗,亮吗,如果你本身的病毒毒粒少,感染时细胞的活性不好,最后得到的病毒滴度也不会有所提高的.在收集病毒是,变圆和飘落是个很典型的状态,病毒在体外的时间不要太上,只要你的293细胞不破裂,收毒的时间就不晚

1.一般空载体的病毒感染其他的细胞也会引起一定的死亡

2.首先腺病毒可以感染你的细胞,要提高转染效率,就提高病毒的滴度,你扩增病毒用的293细胞不够,建议用2个250ML的瓶扩增病毒收集时用1ML重悬,可得到1X1O 8-9pfu/ml,不用纯化。

丁香园网友 xunmixm反馈 :

谢谢kangdejiao指导,我现在的病毒滴度自己觉得应该比较高了。为了验证空载体病毒是否有毒,我使用对外界刺激抵抗力比较高(和我的神经元相比)的Hela细胞做空病毒载体感染,使用50μl感染一个24孔板中的Hela细胞,48h荧光显微镜下观察GFP,感染率接近100%。

使用的是空载体的病毒,现象是感染之后,此空Hela细胞就不再增殖了。不过看到以下现象:Hela细胞形状有变化,长出“触角”,而且呈现聚团状,各个聚团之间好像通过"类似于神经突触样的”连接形成蜘蛛网样的形状-而同时培养,没有感染的孔中,Hela细胞已经铺满整个孔了。形态发生变化的Hela图片见附件(注意,视野取的是24孔边缘,聚焦有点模糊,但是形态还是能看清楚)。

空载体病毒感染后,Hela细胞形态发生显著变化,这种现象在你的实验中有没有出现?我在想,这种变化是不是也是导致被感染的原代神经元死亡的重要原因?

再附一张40倍物镜照片

丁香园网友 kangdejiao 认为:

你感染HELA细胞的图片很正常,要指出的是HELA细胞感染病毒后形态是没有发生变化,由于你感染病毒后细胞无法正常繁殖,细胞也出现死亡后会聚集在一起,就是你的图中圆形的细胞,病毒把细胞撑得很满.很纤细的那些“触角”是因为得不到营养造成的,(正常的HELA细胞本是有很大的“触角”,)

你的病毒滴度不高,在一个24孔板加5UI就可以出现你图中的病变.

如果是这样,你的神经细胞也出现象HELA 细胞的病变就是再正常不过了

丁香园网友 xunmixm :

腺病毒在Hela细胞中是不能增殖的(Hela细胞中缺少病毒必须的E1等),所以,我觉得每个Hela细胞中可能只有很少的1个或者几个病毒颗粒。

在你的实验中,腺病毒感染胶质细胞也会出现这种“病变现象”吗?如果细胞都发生“病变”了,后续实验还怎么进行呢(无法排除病毒造成的影响)。

我的核心问题还是:有没有办法让腺病毒感染的神经元不死亡?

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