鸡胚神经元培养实际操作实验

一、材料

二、步骤

将白色来亨鸡蛋置于预先经过通风处理的（forc-draft)、湿润的鸡蛋孵育器中（如 Agroswede，Malmd,Sweden),37.8℃ 条件下孵育 8d(或规定的时间)。孵育时应将鸡蛋的平钝端朝上，每 2 h 自动翻转 1 次。需注意动物组织的使用需获得法律批准。

生长基质的准备

1.配制并消毒硼酸盐缓冲液（2.37 g 硼砂和 1.55 g 硼酸溶于 500 ml 重蒸水中，pH8.4)；

2.将多聚 D 赖氨酸溶于硼酸缓冲液，浓度为 50ug/ml;

3.适量的多聚 D 赖氨酸溶液涂布于培养皿或培养瓶的内表面；

4.室温孵育 Ih 或过夜；

5.用灭菌的重蒸（馏）水彻底清洗 2~3 次；6. 培养器皿烘干后在紫外线灯下照射 IOmin(照射时间适当选择)。包被处理好的培养器具，4℃ 可保存 1 周，但最好立即使用。

组织分离液和培养液的制备

鸡胚端脑的分离

1.用含有 70%EtOH 或 70% 异丙醇的消毒溶液擦洗小金属或塑料盘。

2.取出鸡蛋，使平钝端朝上，因为鸡蛋的空气端位于钝端，所以这样最容易观察并通过该端的膜取出鸡胚。

3.用乙醇或消毒液擦拭鸡蛋，平钝端朝上，将其放于盒中。

4.当所有的孵育鸡蛋均消毒干燥后，将它们移至超净台内。

5.在三个 60 mm 的塑料培养皿中分别加入 IOml 冰冷的解剖液（根据所收集的胚胎数量调整解剖液的用量)。

6.用镊子背侧将鸡蛋平钝端空气腔上方的蛋壳敲碎并移除，剥去内层的膜。

7.用弯钳夹住胚胎的颈部，小心地将鸡胚取出，注意不要将卵黄囊或它的膜与胚胎一同取出。

8.将取出的胚胎置于含有解剖液的培养皿中，待所有的胚胎都收集齐后，将它们逐个依次地移至另一个培养皿中进行解剖分离,

9.将鸡胚腹侧面朝下，用前面所提及的精细镊从较大的中脑背侧贯穿固定胚胎。

10.用一副精细的锯齿状弯钳分开端脑并将其夹出。

11.用镊子将取出的端脑放到第三个含有新鲜解剖液的培养皿中.

12.当所有的端脑均完整取出并移至第三个培养皿中后，用尖镊仔细将所有的脑膜和血管去除。

13.在 15 ml 锥形管中加入 2 ml 解剖液，用巴斯德吸管小心地将分离的端脑组织移至该锥形管中。

分离组织制成单细胞悬液

1.用消毒的长巴氏吸管反复吹打分离出的端脑，以制备单细胞悬液。这是实验中较为关键的步骤，需经过反复实践才能很好掌握。在吹打时，将吸管尖头插入锥形管底部，慢慢地将组织碎块吸入管中，再以同样的速度吹出，往往需要 1 〇~2 〇次以上的来回吹打。由于气泡可导致细胞的碎裂，因此在吹打过程中应尽量避免将空气吹进液体中。

2.换用直径小一倍的吸管以更快的速度和更高的压力继续吹打 10~20 次。

3.操作中需要注意：吹打过程尽量使用厚壁吸管，这样可提供适度的吹打力量; 注意不要使用有缺口或有裂纹的吸管；吹打的次数要根据是否使用酶消化及以往经验而定；不要试图将所有所能看见的组织块均吹打成单细胞悬液，因为有些组织块是由胞膜和非神经元细胞所构成的，不易被吹开。

4.将单细胞悬液用 2 倍体积（4 ml) 的 DMEM+20%FCS 稀释，并重新补充二价阳离子和营养物。静置 3 min, 让未吹散的组织沉淀。

5.用巴氏吸管小心将上清液移至另一个 I5mI 锥形培养管内，以 200Xg 离心 Imin。

6.弃上清，轻轻加入 5 mlDMEM+20%FCS。轻轻吹打底部的沉淀物使其重新悬浮。该步骤可清除一些死亡细胞碎屑和其所释放出的细胞毒性物质。

7.将 40/xm 细胞筛放在 50mi 塑料锥形培养管的顶端，进行单细胞悬液过滤，用 15 ml 塑料吸管吸取 15~45 mlDMEM+20%FCS 冲洗细胞筛，以除去悬浮液中的聚集细胞。

8.取 50u1 细胞悬液与等体积的台盼蓝溶液轻轻混匀。用血细胞计数仪进行活细胞计数（未被染色的明亮细胞为活细胞)。细胞的数量会受到胎龄以及胚胎数量与培养基体积比的影响。通常，台盼蓝染色所显示的死亡细胞数量控制在 10% 左右的被视为较理想的细胞制备。

接种和细胞培养

1.应根据实验的要求决定细胞接种的密度。通常，髙密度接种有利于提高细胞的存活率，但同时也会增加非神经元的数量。比较不同大小的培养皿和培养瓶中的培养结果，我们推荐使用数量/面积单位而不是数量/体积单位作为细胞接种密度的计量单位。我们建议将接种密度控制在 500?3000 个细胞/mm2。

2.所需培养基的体积应根据所选用的培养皿或培养瓶的大小来决定。对于 35 mm、60 mm、100 mm 的培养皿，一般分别加入 2 ml、3 ml、10 ml 的培养基。而对于 T_25、T-75、T-160 培养瓶，则相应的加入 5 ml、15 ml、30 ml 培养液。对于 96 孔培养板，每个一般加入 50-100% 的培养基，而 24 孔板，每孔加入 0.5 ml 培养基，12 孔 1 ml，6 孔 2 ml。

3.用已消毒枪头的移液器（或多通道移液器）向预先已包被的培养容器内加入适量的细胞悬液，放置于 5%CO2 的 37”C 培养箱内进行培养。

4.24 h 内更换培养液（DMEM+5%FCS)。

5.培养 48 h 后，用无血清白 B27 的神经兀培养基（neur 〇 basalmedium) 换液。

6.通常每 2~3d 换液 1 次（可选择星期一、星期三、星期五)。

7.为获得完全利用人工合成培养基的无血清培养条件，在更换培养基时，应注意将含血清的培养基彻底清除。操作中可利用电动吸引器连接巴斯德吸管将含血清培养基彻底吸除。此步骤应注意动作要快，以避免细胞干涸。同时还需要注意的是，加液时不要直接加在细胞表面，以免对细胞造成损害。

三、结果

神经元培养的定量与定性分析

用高质量的相差显微镜对培养的细胞进行观察，是确定培养的原代神经元的生存状态最重要和显而易见的办法。一般情况下，接种第二天，具有存活能力的细胞就可贴壁。但是要在这个阶段判断存活的细胞是否为神经元细胞，还是比较困难的。培养后 3-4d, 细胞胞体开始变扁平、变透亮，许多突起开始形成，并伸展开来，长度甚至可超过几个胞体的直径。在这个阶段，有经验的专家能够判断出培养细胞的组成成分，但对一般人来说较为困难。

需借助对某些神经元特异性分子标记物的染色技术，来确定所需原代神经元的培养是否已成功建立。通常使用免疫细胞化学标记特异性抗原，而不推荐使用神经解剖时采用的染色技术，因为它的结果常常不肯定。常被使用的神经元特异性抗原标记物包括神经元-特异性浠醇化酶（NSE)、微管相关蛋白（MAP) 或神经元特异性抗原簇 [如谷氨酸脱羧酶（GAD) 或酪氨酸羟化酶（TH) 等转化过程中产生的酶类]。目前一些神经元标记物的抗体已经商品化，随时备用。但仅有神经元特异性抗体是不够的，还需要一些其他类型细胞的抗体做阴性对照，如胶质细胞的特异性标记物—神经胶质元纤维酸性蛋白（GFAP), 该标记物已被广泛地用于胶质细胞的标记鉴定。目前，常用双标方法对培养中的细胞进行鉴定，即用神经元特异性抗体和胶质特异性抗体同时平行地对同一个培养细胞进行标记鉴定。

但是对不同类型神经元的独特性质（如含有神经递质的合成及受体）进行研究时，不能想当然，针对不同目的应采用不同的模型并且要严格地设置对照和验证。