材料与仪器
浓硝酸
玻璃盖玻片 层流柜
玻璃盖玻片 层流柜
步骤
一、盖玻片的预处理
1. 玻璃盖玻片放在瓷染色架上，用蒸馏水冲洗。
2. 架子放在玻璃容器中，浓硝酸泡 48 小时。
3. MilliQ 水漂洗盖玻片 1 小时，重复 3 次。
4. 200℃ 烤 8 小时灭菌盖玻片。
5. 在层流柜中将盖玻片放在 60 mm 培养皿，外边缘放两粒（1~2 mm 高）融化的无菌 Paraplast。颗粒的大小决定了盖玻片和培养皿单层神经胶质细胞间的分离程度。
6. 加入 5 ml 过滤除菌的溶于硼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.5）的 1 mg/ml poly-L-lysine 溶液，室温过夜。
7. 无菌 MilliQ 水漂洗 1 小时。重复 3 次。
8. 吸出漂洗液，加 5 ml 接种培养基（MEM 加 10% 马血清），接种分离神经元之前放在 CO2 温箱中 37℃ 孵育至少 24 小时。
二、单层神经胶质细胞的制备
1. 去掉 1~3 天幼大鼠的头。
2. 在层流柜中从头颅骨上取下脑，放在盛有 BSS 的培养皿中。
3. 在解剖显微镜下取出脑半球，完全剥离脑膜、切碎脑组织，放入盛有 25 ml 0.25% 胰酶 BSS 溶液的 50 ml 组织培养管。
4. 37℃ 水浴孵育 30 分钟。
5. 小心吸出胰酶溶液，加 25 ml BSS，用巴斯德吸管吹散细胞。
6. 离心收集细胞（1000 r/min，10 分钟），悬于接种培养基中。
7. 计数细胞，悬液稀释至 200000 细胞/ml，取 4 ml 接种 60 mm 组织培养皿。
8. 24 小时后倒掉培养液，加 5 ml 新鲜培养液。
9. 每周换一次培养液，神经胶质细胞 70% 长满时即可用于共培养。
10. 制备神经元培养物时，提前一天更换神经元培养液，加 6 ml 维持培养液继续培养。
1. 玻璃盖玻片放在瓷染色架上，用蒸馏水冲洗。
2. 架子放在玻璃容器中，浓硝酸泡 48 小时。
3. MilliQ 水漂洗盖玻片 1 小时，重复 3 次。
4. 200℃ 烤 8 小时灭菌盖玻片。
5. 在层流柜中将盖玻片放在 60 mm 培养皿，外边缘放两粒（1~2 mm 高）融化的无菌 Paraplast。颗粒的大小决定了盖玻片和培养皿单层神经胶质细胞间的分离程度。
6. 加入 5 ml 过滤除菌的溶于硼酸缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.5）的 1 mg/ml poly-L-lysine 溶液，室温过夜。
7. 无菌 MilliQ 水漂洗 1 小时。重复 3 次。
8. 吸出漂洗液，加 5 ml 接种培养基（MEM 加 10% 马血清），接种分离神经元之前放在 CO2 温箱中 37℃ 孵育至少 24 小时。
二、单层神经胶质细胞的制备
1. 去掉 1~3 天幼大鼠的头。
2. 在层流柜中从头颅骨上取下脑，放在盛有 BSS 的培养皿中。
3. 在解剖显微镜下取出脑半球，完全剥离脑膜、切碎脑组织，放入盛有 25 ml 0.25% 胰酶 BSS 溶液的 50 ml 组织培养管。
4. 37℃ 水浴孵育 30 分钟。
5. 小心吸出胰酶溶液，加 25 ml BSS，用巴斯德吸管吹散细胞。
6. 离心收集细胞（1000 r/min，10 分钟），悬于接种培养基中。
7. 计数细胞，悬液稀释至 200000 细胞/ml，取 4 ml 接种 60 mm 组织培养皿。
8. 24 小时后倒掉培养液，加 5 ml 新鲜培养液。
9. 每周换一次培养液，神经胶质细胞 70% 长满时即可用于共培养。
10. 制备神经元培养物时，提前一天更换神经元培养液，加 6 ml 维持培养液继续培养。
来源：丁香实验
