免疫组化实验方法

一、免疫组化（Immunohistochemistry,IHC/ Immunocytochemistry, ICC）原理

免疫组化是应用免疫学基本原理--抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素） 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（Immunocytochemistry）。

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。

通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

用于病理诊断的主要有免疫荧光法和免疫酶法。免疫荧光法是现代生物学和医学中广泛应用的方法之一，包括荧光抗体和荧光抗原技术，具有抗原抗体反应的特异性，染色技术的快速性，在细胞或组织上定位的准确性，以及荧光效应的灵敏性等优势。

但是，由于免疫荧光法必须具有荧光显微镜，荧光强度随时间的延长而逐渐消退，结果不易长期保存等缺点，在普及应用上受到一定限制，而逐渐被免疫酶法所取代。

二、IHC/ICC实验方法

1、仪器设备

（1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；

（2）水浴锅。

2、试剂

（1）PBS缓冲液（pH7.2~7.4）：NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L。

（2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB,pH6.0,1000ml）：柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g。

（3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O,用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

（4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

（5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

（6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

（7）封裱剂：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0~9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配制。

（8）TBS/PBS pH9.0~9.5,适用于荧光显微镜标本；pH7.0~7.4适合于光学显微镜标本。

3、操作流程

（1）脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

2）无水乙醇中浸泡5分钟；

3）95%乙醇中浸泡5分钟；

4）70%乙醇中浸泡5分钟；

（2）抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复

在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

2）煮沸热修复

电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

3）微波热修复

在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

4）酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

（3）免疫组织化学染色

常见的染色方法有两种：SP法，SABC法。以下分别列出两种方法的实验步骤。

SP法

1）脱蜡、水化；

2） PBS洗2~3次各5分钟；

3）3%H₂O₂（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟

4）PBS洗2~3次各5分钟；

5）抗原修复；

6）PBS洗2~3次各5分钟；

7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10）PBS洗3次各5分钟；

11）滴加Ⅱ抗40~50μl,室温静置，或37℃1小时；

12）抗中可加入0.05%的tween-20.

13）BS洗3次各5分钟；

14）DAB显色5~10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

15）PBS或自来水冲洗10分钟；

16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；

17）自来水冲洗10~15分钟；

18）脱水、透明、封片、镜检。

SABC法

1）脱蜡、水化。

2）PBS洗两次各5分钟。

3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H₂O₂，室温封闭5~10分钟，蒸馏水洗3次。

4） 抗原修复。

5） PBS洗5分钟。

6） 滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

7） 滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

8） PBS洗三次每次2分钟。

9） 滴加生物素化二抗，20℃~37℃20分钟。

10）PBC洗3次每次2分钟。

11）滴加试剂SABC，20℃~37℃20分钟。

12）PBS洗4次每次5分钟。

13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15）脱水、透明、封片、镜检。