基因芯片检测原理

杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。以往的研究中已形成许多种探测分子杂交的方法，如荧光显微镜、隐逝波传感器、光散射表面共振、电化传感器、化学发光、荧光各向异性等等，但并非每种方法都适用于DNA芯片。

由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。

由于所使用的标记物不同，因而相应的探测方法也各具特色。大多数研究者使用荧光标记物，也有一些研究者使用生物素标记，联合抗生物素结合物检测DNA化学发光。通过检测标记信号来确定DNA芯片杂交谱型。

1．荧光标记杂交信号的检测方法

使用荧光标记物的研究者最多，因而相应的探测方法也就最多、最成熟。由于荧光显微镜可以选择性地激发和探测样品中的混合荧光标记物，并具有很好的空间分辨率和热分辨率，特别是当荧光显微镜中使用了共焦激光扫描时，分辨能力在实际应用中可接近由数值孔径和光波长决定的空间分辨率，而在传统的显微镜是很难做到的，这便为DNA芯片进一步微型化提供了重要的检测方法的基础。

大多数方法都是在人射照明式荧光显微镜（epifluoescence microscope）基础上发展起来的，包括激光扫描荧光显微镜、激光共焦扫描显微镜、使用了CCD相机的改进的荧光显微镜以及将DNA芯片直接制作在光纤维束切面上并结合荧光显微镜的光纤传感器微阵列。这些方法基本上都是将待杂交对象 以荧光物质标记，如荧光素或丽丝胶（lissamine）等，杂交后经过SSC和SDS的混合溶液或SSPE等缓冲液清洗。

（1）激光扫描荧光显微镜

探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为5－10μm。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台X－Y方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20μm象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。

（2）激光扫描共焦显微镜

激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。Affymetrix公司的S．P．A．Forder等人设计的DNA芯片即利用此方法。其方法是将靶 DNA分子溶液放在样品地中，芯片上合成寡核苷酸阵列的一面向下，与样品池溶液直接接触，并与DNA样品杂交。当用激发光照射使荧光标记物产生荧光时，既有芯片上杂交的DNA样品所发出的荧光，也有样品地中DNA所发出的荧光，如何将两者分离开来是一个非常重要的问题。

而共焦显微镜具有非常好的纵向分辨率，可以在接受芯片表面荧光信号的同时，避开样品池中荧光信号的影响。一般采用氩离子激光器（488nm）作为激发光源，经物镜聚焦，从芯片背面入射，聚集于芯片与靶分子溶液接触面。杂交分子所发的荧光再经同一物镜收集，并经滤波片滤波，被冷却的光电倍增管在光子计数的模式下接收。经模数转换反转换为数字信号送微机处理，成像分析。

在光电信增管前放置一共焦小孔，用于阻挡大部分激发光焦平面以外的来自样品池的未杂交分子荧光信号，避免其对探测结果的影响。激光器前也放置一个小孔光阑以尽量缩小聚焦点处光斑半径，使之能够只照射在单个探针上。通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约 12万美元。

（3）采用了CCD相机的荧光显微镜

这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于不是逐点激发探测，因而激发光照射光场为整个芯片区域，由CCD相机获得整个DNA芯片的杂交谱型。这种方法一般不采用激光器作为激发光源，由于激光束光强的高斯分布，会使得光场光强度分布不均，而荧光信号的强度与激发光的强度密切相关，因而不利于信号采集的线性响应。为保证激发光匀场照射，有的学者使用高压汞灯经滤波片滤波，通过传统的光学物镜将激发光投射到芯片上，照明面积可通过更换物镜来调整；也有的研究者使用大功率弧形探照灯作为光源，使用光纤维束与透镜结合传输激发光，并与芯片表面呈50o角入射。由于采用了CCD相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。

（4）光纤传感器

有的研究者将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200μm，两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490urn），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由CCD相机接收。每根光纤单独作用互不干扰，而溶液中的荧光信号基本不会传播到光纤中，杂交到光纤远端的靶分子可在90％的甲酸胺（ formamide）和TE缓冲液中浸泡10秒钟去除，进而反复使用。这种方法快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模DNA芯片，有一定的应用局限性。

2.生物素标记方法中的杂交信号探测

以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。

目前应用较多的是美国General Scanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray 5000，其扫描精度和功能有较大的提高。