基因芯片检测HLA-undefined27
欧蒙医学诊断
强直性脊柱炎（AS）是一种以脊柱为主要病变的慢性自身免疫性疾病,该病的发展会造成不同程度的骨骼、肌肉、眼、肺病变。虽然这是一种很古老的疾病，几千年前古埃及人的骨骼中就发现有强直性脊柱炎的证据，在2000年以前希腊名医希波克拉底就对此病进行了描述，但其病因和致病机理却至今尚未阐明。但在众多病因研究结果中，遗传基因HLA-undefined27是最受公认的诱因，它与AS的相关性早在40年前就被认识到了。因此检测该基因的携带情况对AS的诊断具有很大帮助，本文将着重介绍该基因的基因芯片检测技术。
HLA的结构功能：
HLA（人类白细胞抗原）又称人类主要组织相容性复合物（MHC）。HLA基因位于人类第6号染色体上, 包括I, II, III类基因, HLA-undefined27就是属于HLA-I类基因中B座位上的第27主型。依据IMGT/HLA database显示目前已发现HLA-undefined27有78种亚型，从HLA-undefined2701到HLA-undefined2779，各种亚型之间仅仅是少数几个碱基的差别(Release 3.3.0,14-January-2011)。
HLA-B
图一：HLA-B27分子及其编码基因示意图(摘自：医学免疫学/陈慰峰主编，第三版。人民卫生出版社2000年)
L:前导序列，Tm+C:跨膜序列，C:胞浆序列
HLA-undefined27的临床意义：
近四十年来，全球各地关于HLA-undefined27和强直性脊柱炎关联的调查研究一方面强烈提示两者之间的密切关联，如Brown等研究发现强直的患者中90%携带HLA-undefined27基因[1],撒哈拉以南非洲的人群普遍存在HLA-undefined27基因缺失，同时该地区AS的发病也极为罕见[2]。另一方面，约有3%-6%HLA-undefined27基因携带者发展成强直患者。进一步研究发现，在众多的HLA-undefined27亚型中HLA-undefined2702, HLA-undefined2704和HLA-undefined2705亚型与AS的相关性最强，而HLA-undefined2706和HLA-undefined2709亚型的发病风险最弱[3,4].中国人群的研究显示HLA-undefined2704与AS的相关性高于HLA-undefined2705[5,6]。尽管HLA-undefined27指标的检测未成为AS的诊断标准，但对于AS与类似症状疾病的鉴别诊断以及疾病的早期预测和辅助诊断有极高的阴性预期值和风险系数(HLA-B27阳性个体患SpAs的危险性较阴性者大100倍)[7]，并且HLA-undefined27基因的研究也为阐明AS病理机制和探索治疗方法的提供了实验依据。
目前HLA-undefined27与AS的关联研究已经拓展到其他类型的脊柱关节炎(SpA)，包括赖特综合征（RS）、反应性关节炎（ReA）、外周关节炎、银屑病关节炎(PA)、幼年发病的脊柱关节病（JSpA）和炎症性肠病(IBD)。研究显示HLA-undefined27与上述疾病也有一定的相关性[7]。
HLA-undefined27的检测方法：
实验室的检测分为两大类。一种是检测细胞膜表面HLA-undefined27编码的蛋白。最早的检测方法是淋巴细胞毒试验，取受检者淋巴细胞，加入到特异性抗体包被的微孔中温育，HLA-undefined27阳性细胞会被之后加入的补体激活而启动细胞毒杀伤程序，凋亡的细胞最终通过染色被识别。这种方法是经典的检测方法，也已成为之后发展的新方法的参照标准，但缺点是蛋白检测的敏感性不够高，需要新鲜活细胞样本，操作繁琐，结果判读中的主观因素影响较大，同时抗原抗体结合中的HLA-B7的交叉反应也影响了结果的特异性[8]。新发展的基于流式细胞术的检测方法，同样需要采集新鲜淋巴细胞，混入预先标记荧光素的特异性抗体，温育后洗涤，通过流式细胞仪对阳性细胞计数。这种方法在结果判读上实现了客观化、标准化和自动化，相对于前者是一个很大的进步，但仍然无法解决交叉反应和一定要使用新鲜样本的问题。
另一种是检测特异的DNA序列。这一类方法需要获取受检者的基因组DNA，运用HLA-undefined27片段特异的引物进行PCR扩增，检测样本中是否携带HLA-undefined27。这种方法的关键在于设计引物时，需要通过选择其3’端碱基在靶序列上的结合位点，以达到只有HLA-undefined27片段获得扩增，而非其他HLA-B等位基因的目的, 这种方法称为序列特异性引物PCR，简称PCR-SSP法。该方法时效快，操作简便，无需新鲜样本。但是其假阳性率偏高一直是该法被诟病的原因。随后发展起来的PCR-SSOP法（序列特异性寡核苷酸探针PCR），采用一段与HLA-undefined27 PCR扩增产物特异性配对的寡核苷酸探针，再次筛检PCR产物，很大程度上降低了PCR-SSP法的假阳性率，提高了检测的特异性。
运用PCR-SSOP法的原理，将针对HLA-undefined27扩增产物的特异性寡核苷酸探针预先固定在玻璃等低干扰的材质上，对PCR-SSP产物进行筛检，如样本中携带HLA-undefined27，特异性探针就能与目标产物结合，发出荧光信号，被仪器检测到，这种产品就是俗称的基因芯片。基因芯片技术被认为是现代临床检验的发展方向，原因就在于其基于高敏感性的基因扩增技术，通过序列特异性引物和探针，实现检测结果的高特异性，而且可以在小尺寸的材料上固定大量的探针，通过自动化设备的运用，满足临床检测高通量、标准化需求。
图二：“基因芯片”检测HLA-B27原理
HLA-undefined27的基因芯片检测技术涉及了从基因组DNA制备、特异性基因片段扩增到产物筛检等一系列环节。因此基因芯片检测体系的设计不但针对PCR阳性产物的筛选，也同时兼顾了上述检测环节的质量控制。为此该体系包含了以下一系列的质控物质：
DNA阳性质控：针对DNA制备是否成功以及PCR扩增过程有无差错的质控问题，HLA-undefined27的基因芯片检测体系包含了两种阳性质控物质，即PCR反应液中用以扩增β2微球蛋白基因片段的特异性引物和在芯片上包被的检测β2微球蛋白基因扩增产物的探针。β2微球蛋白广泛存在于有核细胞的细胞膜表面，而且序列保守程度高。如果最终检测结果显示该探针并未与PCR产物发生特异性结合，即说明在DNA制备或者PCR过程中发生错误。
HLA-undefined27阳性对照：除了为实验流程设置的DNA阳性质控外，体系还引入了HLA-undefined27阳性对照，用于检验HLA-undefined27引物是否正常工作。质控物包括添加于PCR反应液中的一段人工合成寡核苷酸，以及芯片上的探针。反应液中的寡核苷酸的3’端部分是和HLA-undefined27引物互补的序列，其余的5’端部分是一段重复碱基序列，探针也是一段相同的重复碱基序列，如果引物成功工作，最终能检测到荧光信号。
PCR特异性质控：如何避免PCR过程中的非特异性产物？质控物包括添加在PCR反应液中的一段人工合成寡核苷酸，以及芯片上的探针。反应液中的寡核苷酸的3’端部分是和HLA-undefined27引物不完全互补的序列，其余的5’端部分是另一段重复序列，探针也是与之相同的重复序列。如果无非特异性反应发生，不会产生可以与探针互补的扩增产物。最终，没有信号产生。
杂交过程的质控物：SSOP相对于SSP法多出杂交的反应流程，因此相对于SSP需要设计杂交过程的质控物。这类质控物包括杂交液中含有的一段荧光标记的人工合成寡核苷酸，和芯片上包被的两条探针，其中一条可以和荧光标记的质控物完全互补，另一条却不完全互补。如果最终检测结果显示前者的信号强度明显高于后者，提示具有良好的杂交特异性。
图三：“基因芯片”检测HLA-B27流程图
如上所述，目前已知HLA-undefined2706或undefined2709是与AS发病无关的亚型，甚至有学者认为这两者起保护作用，因此确定样品中是否存在这两种亚型，对AS的诊断具有很重要的辅助意义，而蛋白检测很难做到这一点。基因芯片技术分别通过2对引物，同时扩增外显子2和外显子3，随后通过2条特异性探针分别检测这两段扩增产物。在此，引物特别设计成：外显子3的引物不能扩增HLA-undefined2706和undefined2709。因此当最终探针检测结果显示外显子2和3均为阳性或仅外显子3阳性而外显子2阴性时，就排除了样本中HLA-undefined2706和undefined2709的存在，为AS的确诊提供了极有价值的参考。
序列特异性引物和探针的运用加上多点质控的引入不但使HLA-undefined27基因芯片检测的准确性要高于PCR-SSP技术，而且相对于抗原检测更能有效避免HLA-B7的交叉反应，实现无关亚型的鉴别诊断。同时在操作方面，这种技术不要求活细胞，因此可以收集样本集中检测，有效节省人力成本和试剂成本。但是，由于基因产物表达过程还受到复杂的遗传调控和组织环境因素影响，因此蛋白检测也不容忽视，两种检测的意义并不等同。在实验室的检测中，我们需要充分了解各种方法的优劣，根据试验目标来选择最佳的方法或最优的检测方案。有机的结合两类方法，不仅仅能提高检测结果的精准性，同时对研究疾病遗传和表观性质也极具价值。
参考文献：
1. Brown MA, Pile KD, et al. HLA class I associations of ankylosing spondylitis in the white population in the United Kingdom. Ann Rheum Dis. 1996; 55:268-70.
2. Khan MA. HLA-B27 and its subtypes in world populations. Curr Opin Rheumatol. 1995; 7:263-9
3. Khan MA. Update on spondyloarthropathies.Ann Intern Med. 2002; 136:896-907
4. Paladini F, Taccari E, et al. Distribution of HLA-B27 subtypes in Sardinia and continental Italy and their association with spondylarthropathies. Arthritis Rheum. 2005；52:3319-21
5.Mou Y, Wu Z, et al. HLA-B27 polymorphism in patients with juvenile and adult-onset ankylosing spondylitis in Southern China. Tissue Antigens. 2010; 75:56-60.
6.Liu Y, Jiang L, et al. Predominant association of HLA-undefined2704 with ankylosing spondylitis in Chinese Han patients. Tissue Antigens. 2010; 75:61-4.
7.张江林，黄烽. HLA-B27检测的进展及其临床意义;中国实用内科杂志;2002年5期.
8. Levering WH, Wind H, et al. Flow cytometric HLA-B27 screening: cross-reactivity patterns of commercially available anti-HLA-B27 monoclonal antibodies with other HLA-B antigens. Cytometry B Clin Cytom. 2003; 54:28-38.
