PCR-SSP法在HLA-B27检测中的应用

摘要 应用序列特异引物聚合酶链反应（PCR-SSP）技术对181例临床标本进行HLA-B27检测，同时作血清学试验。结果：PCR方法和血清学方法分析结果基本相符，PCR分型无假阳性及假阴性，血清学方法1例假阳性及1例假阴性，表明PCR方法灵敏度高、特异性好、准确、较之血清学方法更适合于临床。

关健词 PCR-SSP HLA-B27

人类白细胞抗原B27（HLA-B27），是诊断强直性脊柱炎的指标之一，对强直性脊柱炎的早期诊断和预后以及对类风湿关节炎的鉴别诊断起着极其重要的作用。

以前国内大多采用血清学方法对HLA-B27进行检测，近来国内外有报道应用PCR技术对HLA-B27进行检测，具有简便快速，灵敏度高，特异性好，准确等特点。2001年3-6月，我科对全部进行HLA-B27检测的病人运用PCR-SSP法进行检测的同时，也进行了血清学检测，现报告如下：

1. 材料与方法

1. 1材料

1.1.1引物特异性引物有2个。B27引物序列为：P1 51-CAG,TCT,GTG,CCT,TGG,CGT,TGC;P251-GGC,TAC,GTG,GAC,ACG,CT.PC产物为144bp.51-TCA,CGG,ATT,TCT,GTT,GTG,TTT,PCR产物429 bp.以上引物由美国G&T Biotecli公司提供。

1.1. 2临床样本 181份来源于临床进行HLA-B27检测的患者。

1.1. 3PCR扩增仪 购自上海复星公司,型号PTC-100。

1.1.4电泳仪 上海西巴斯生物技术公司研制,型号DY-A。

1.1. 5HLA-B27分型血清板 由广州医学院神经研究所提供,含阴阳性对照。

1.1. 6倒置显微镜 日本奥林巴斯光学仪器有限公司研制的CK-2。

1.2. 方法

1.2.1摸拟DNA提取 取EDTA抗凝静脉血0.3ml 采用快速酚氯仿抽提DNA。

1.2.2PCR扩增PCR反应体至25μl，其中B27引物2μmol/L，

内对照物1μmol/L,Mgcl2 2mmol/L 17.5mmol/Ltric,Kcl37.5mmol/L,

DNTP200μmol/L,5%Dmso,Taq酶0.5μ模板DNA22.5μl。

1.2.3扩增条件 95摄氏度变性5分钟，然后95摄氏度30秒，60摄氏度30秒，72摄氏度90秒共30个循环。

1.2.4PCR产物检测 以2%琼脂糖（含0.5μg/ml溴乙锭），0.5XTEB电泳20分钟（5V/CM），紫外灯下观察结果。

1.2.5血清学分型 按标准微量淋巴细胞毒试验进行。

2 结果 用PCR-SSP法对HLA-B27分型全部成功，无假阳性及假阴性，其中阳性42名，占23.2%，阴性139名，占76.8%诊断为强直性脊柱炎的患者阳性例数为38，阳性例数34名，阳性率89.5%，可疑强直性脊柱炎的患者阳性例数11，阳性例数2，阳性率18.2%。证明HLA-B27基因与强直性脊柱炎呈强相关。

　　表1 PCR-SSP法检测HLA-B27结果 　　

血清学方法对HLA-B27检测结果基本与PCR-SSP法相符，用血清学方法及PCR-SSP重复检测，证实1例为假阳性，1例为假阴性。

　　 表2 血清学法检测HLA-B27结果 　　　　　

3 讨论 对HLA-B27基因的检测，传统上大多采用血清学方法，即检测细胞表面的B27抗原，影响因素较多，易造成分析结果错误，我们对181例患者用血清学方法进行HLA-B27定型，其中1例假阳性。

疑是抗原交叉反应以及操作过程中孔间的交叉污染造成，而1例假阴性，则考虑可能是抗体和补体在运输及保存过程中效体下降所致。PCR-SSP法在基因水平对HLA-B27进行检测，操作简便，影响因素相对较少，灵敏度高，特异性好，无假阳性，假阴性现象，较之血清学方法，适用于临床。

4参考文献

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