小鼠单个核细胞的分离

小鼠单个核细胞的分离

基本方案：

从脾脏、胸腺和淋巴结制备细胞悬液

实验材料：

1. RPMI-5或DMEM-5完全培养基

2. 新鲜分离的小鼠器官：≤6周龄的小鼠胸腺；6周至6个月龄的小鼠脾脏和淋巴结

3. 60mm×15mm培养皿

4. 剪刀和镊子（保存在70%乙醇的烧杯中

5. 装有19G针头的6ml注射器

6. 200μm尼龙滤网

实验方法：

1. 将新鲜分离的器官放入盛有3ml RPMI-5或DMEM-5完全培养基的60mm×15mm培养皿（每种器官一个培养皿）中，用剪刀将器官剪碎。

2. 用6ml注射器的活塞将组织块向培养皿底面用力挤压直至仅剩纤维组织。

3. 用装有19G针头的6ml注射器将组织悬液反复抽吸数次，以进一步粉碎组织团块。

4. 将细胞悬液通过200μm尼龙滤网滤入离心管中。用约4ml完全培养基洗一次培养皿，如需要则重复一次，之后将洗液通过滤网加入离心管中。

5. 在Sorvall H-1000B离心机中以1000r/min（200g）离心10min后弃上清（如需要去除红细胞和死细胞，见辅助方案）。用20ml完全培养基将沉淀重悬后离心，再以适量培养基重悬以便计数。

6. 如细胞不能立即处理，最好的保存细胞活力的方法是将细胞悬液置于冰块中。这种处理也能减少因细胞贴壁引起的细胞损失。

附录：

RPMI-5完全培养基：

RPMI1640培养基（Life Technologies）含有:

5%FBS,56℃热灭活1h

10mmol/L HEPES

20μg/ml硫酸庆大霉素

50μmol/L 2-ME