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电致化学发光生物检测技术的新进展

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【摘要】电致化学发光作为一种分析技术,不仅可用于化学分析,而且正在被越来越多地用于生物检测和传感技术中。随着该分析技术与免疫检测技术生化固定化技术和微细加工技术等的相互融合,电致化学发光生物检测技术具有了更高的精度、分辨率和更广的应用范围。

【关键词】电致化学发光 生物检测 固定 免疫分析 微细加工 评述

一、引 言

电致化学发光生物分析是最近发展起来的一种新型的分析方法,是化学发光、电化学、生物分析、微电子技术以及传感技术相结合的最新产物,主要用于临床、农业、环境监测等领域。电致化学发光(ECL)是某些具有电致化学发光活性的物质处在一定的电位时,与溶液中氧化还原物质作用生成的不稳定激发态迁移回基态时所导致的化学发光。它具有灵敏度高、 重现性好、可连续检测、检测速度快和装置简单等特点,目前被研究最多的电化学发光活性物质包括三联吡啶合钌(Ru(bpy)32+)、鲁米诺等等。

虽然电致化学发光现象早在1929年就被观察到,但被用于生物分析是最近几年才开始的,尤其是应用在生物芯片分析技术中后,ECL技术得到了更多的重视和更大的发展。结合近几年ECL技术在生物分析领域中的应用状况ECL生物传感器技术主要在免疫标记技术、生物化学固定化技术与微细加工技术等3方面得到了长足的发展。

二、应用与发展

(一)免疫标记技术日益融合

虽然电致化学发光经过了多年的研究和发展,但结合标记技术将电致化学发光应用在免疫分析上还是一个新的研究领域。免疫分析研究的物质基础是抗体和抗原,对抗原和抗体进行特殊标记是免疫技术的关键。常规的免疫分析包括荧光免疫分析、放射免疫分析和酶联免疫分析,但放射免疫技术存在放射污染,酶联免疫技术虽然避免了放射污染,但灵敏度却未达到放射免疫技术的水平,荧光免疫技术由于检测手段复杂,发光时间短,导致应用范围窄,灵敏度不高。

电致化学发光免疫分析技术(ECLIA)是利用化学发光剂作为标记物标记抗体或抗原而形成稳定的复合物。当这种复合物与被检测物中对应的抗原或抗体结合后,在加电电极的作用下激发出特异的光,根据发光的强度可检测出被测物的浓度等参数值。ECL免疫分析可分为直接法、双夹心法和竞争法等3种方法,其中直接法主要用于检测抗体,双夹心法主要用于测定大分子抗原,竞争法主要用于测定小分子抗原。与荧光、放射和酶联等常规的免疫技术相比,ECLIA有以下优点:

(1)无放射性辐射危害;

(2)灵敏度高,检测线性范围在6个数量级,下限值为1pmol,达到或超过放射免疫技术水平;

(3)检测线性范围快,检测仅需几分钟到十几分钟;

(4)稳定性好,自动化程度高;

(5)应用范围宽,既可检测不同分子大小的5抗原、半抗原和抗体,又可用于核酸探针的检测。基于上述优势,电致化学发光技术正被越来越多地应用在生物分析领域中,用于蛋白质、激素、肿瘤、病毒、毒物等成分析检测,服务于临床、卫生、食品、环保和军事等领域。

1、蛋白质、激素和肿瘤检测

Nicbolas等报道了人绒毛膜促性腺激素、前列腺特异性抗原的双
抗体夹心ECLIA测定,同时用竞争ECLIA法测定游离甲状腺素;肿瘤坏死因子是能引起肿瘤组织出血性坏死的一类细胞因子,Moreau发现可溶性肿瘤坏死因子受体sTNF-R55和sTNF-R75对TNF-a的ECLIA测定有很大的影响,并指出延长温育时间和提高俘获抗体的浓度将有利于降低干扰;ECLIA还可用于白细胞介素的测定,如IL-1b、IL-2和IL-4等,也可用于抗人IgG、兔抗鼠IgG和牛血清白蛋白等抗体的测定;张忠英等用ECLIA技术检测细胞角蛋白面19片段(CYFRA21-1)和癌胚抗原(CEA),将其作为肺癌的辅助诊断指标,两者联合检测敏感性可高达84.6%;Satoka等通过将鲁米诺固定在铂金电极上, 用ECL流动注射法测量人血清白蛋白,测量范围为0-100 mg/mL;罗伟等测定了血清异常凝血酶原,并结合甲胎蛋白指标联合检测,使原发性肝癌的阳性率提高到84%以上。

2、病毒、毒物检测

Gatto-Menking用ECLIA技术对肉毒杆菌毒素、蓖麻蛋白、霍乱亚基和葡萄球菌肠毒素等生物毒素和炭疽杆菌芽孢进行了测定;Yu等报道了伤寒沙门氏菌、鼠疫抗原等的ECLIA测定;Christophe等通过鲁米诺标记的抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗检测致癌物2,4-二氯苯氧基
乙酸,检测线性范围为0.2ug/L--200mg/L。

3、其它方面应用

Yasuo等建立了鲁米诺-过氧化氢体系的ECLIA分析方法,并把它用于人免疫球蛋白、人血清白蛋白及人中性粒细胞溶菌酶的测定;Aizawa把鲁米诺标记的抗体上,用光子计数的方法灵敏地检测在光透电极上进行电化学发光释放的光子,建立了该体系的免疫电化学发光分析方法。另外,电致化学发光试剂特别是钌螯合物作为标记物,标记生成核酸探针,也正在被越来越多地应用于免疫测定领域,包括测定病毒HPV、HIV等。由于Ru(bpy)32+的分子量较酶标记小很多,可在核酸分子上进行多个标记(大于20个)而不影响核酸的杂交活性和特异性, 再加上Ru(bpy)32+可在ECL反应中进行再生循环反应,使得一个标记物在每个检测周期中有几个光子生成, 因而分析灵敏度很高,标记物检出极限可达200fmol/L。

(二)与生物化学固定化技术日益融合

电致化学发光应用到生物检测中,用于检测病毒、肿瘤、毒物等,主要在溶液中进行,需要将被测物质、发光活性物质配置成一定比例的溶液注入电极反应池中。反就完毕后需要清洗反应池和电极,过程比较复杂,而且检测灵敏度也受到限制。

在20世纪90年代中期,有研究者将磁珠应用到电致化学发光免疫检测中,其原理是使用物理吸附、包埋和共价结合等生化固定方法通过聚合物将抗体(抗原)固定在纳米级的磁珠上,注射到装有电极的反应池中, 电磁场将磁珠吸附在反应池的底部;然后将待测物质溶液注射到反应池中,待测物质溶液中的目标抗原(抗体)与固定在磁珠表面的抗体(抗原)结合,其它的非目标物质则被从反应池中冲洗掉,再将发光剂标记的抗体(抗原)注射到反应池中,最终形成偶联磁珠抗体(抗原)-待测目标抗原(抗体)-发光剂标记的抗体(抗原)夹心复合体。形成的复合体在加电电极的作用下会产生特异性发光,通过检测发光强度,可测出待测目标物质的含量。磁珠固定方法有效解决了免疫检测过程中非特异物质有效分离的问题,大大提高了检测灵敏度,在免疫检测中得到越来越广泛地使用。磁珠ECL技术不仅可用于免疫检测中,还可用于酶及底物、DNA等对象的分析和检测。为使生物物质紧密、稳固地固定在磁珠表面, 目前主要采用3种固定化方法:

(1)通过二亚胺碳将带氨基的生物物质固定在羧基修饰的磁珠表面;

(2)通过戊二醛将带氨基的生物物质固定在氨基修饰的磁珠表面。通过链亲和素--生物素复合物将生物物质固定在链亲和素包被的磁珠表面。其中第3种方法,由于链亲和素包被的磁珠能结合多个生物素分子,具有多级放大的作用,所以能大大提高检测的灵敏度,正被越来越多地用于磁珠ECL检测系统中。

另一种固定技术是发光活性物质或酶直接固定在电极表面,固定的方法有静电吸附、共价结合、电化学聚合、光聚合和包埋等,使用的固定物有导电高分子聚合物如聚吡咯和聚苯胺、类脂膜如磷脂、溶胶--凝胶及天然高分子化合物如壳聚糖等,不仅使较昂贵的发光活性物质或生物酶能够重复使用,还提高了电致化学发光分析方法的效率。赵志常等用壳聚糖和溶胶--凝胶包埋三联吡啶合钌制成复合膜电极,用ECL方法测定了内氨酸等8种物质的特异发光电压;Leca等将维生素B氧化酶用二乙氨乙基修饰的聚合物通过光聚作用固定在电极上,反应生成的H2O2和电极电压激发鲁米诺发光,测试了溶液中维生素B浓度,测量范围为undefined10-8~undefined10-4mol/L;

Wang等将发光剂三联吡啶合钌通过静电吸附方法固定在苯磺酸修饰的碳玻电极上,测试三丙胺浓度对ECL强度的影响;与磁珠固定方法相比,活性物质电极固定的ECL方法仍处于研究阶段,其稳定性较差和易脱附等问题还有等于进一步解决。但由于这种方法在生物检测方面有其不可比拟的优势, 在将来一定会得到更迅速的发展。

(三)与微细加工技术日益融合

由于生物芯片特别是基因芯片技术的发展,越来越多的人看到了ECL技术应用到生物芯片上的诱人前景。ECL反应池、电极被制作得越来越小,分析所需的样品量也随之越来越少,而检测精度却越来越高。半导体光刻技术、厚膜薄膜技术、丝网印刷技术等应用于其它高科技领域的技术被引用到制作电致化学发光分析系统中,为该系统拓展了一个全新的发展空间,使系统的集成度和微型化等性能得到大幅度的提高。

Fiaccabrino等设计了磁珠流动注射式ECL检测装置,在5mundefined6mm的硅基片上制作了微型的ECL探针,包括电极、反应池和电传感器。电极为金或铂金的插指电极,用光刻的方法刻蚀在硅基片上,1mm长即包含125对电极,每个电极宽3.2um,电极间距0.8um;反应池用覆盖在硅片上环氧树脂刻蚀而成,光电二极管紧贴反应池,接收ECL反应产生的光,以检测被测物质的含量,反应池可容纳的溶液量为2.25uL。该装置被用于检测可待因,线性范围为0.1~2mmol/L;用于检测葡萄糖,其线性范围为50~500mol/L。

随着毛细管电泳(CE)芯片技术的发展,ECL与CE芯片的联合应用的报道越来越多。Gilman报道了一种基于鲁米诺的CE电致化学发光探测器,在阴极缓冲池中设计一个10um的碳或铂金钎维电极,出口直径为25um的分离毛细管, 鲁米诺-ECL反应产生的光被两根光纤收集并被送到PNT探测;Meitsu等设计了一种基于Ru(bpy)33+的CE的ECL探测器、Ru(bpy)32+被注入到CE的阴极缓冲池中,厚度100nm氧铟锡膜被镀在玻璃平板上,将其置于毛细管的出口处,用做工作电极,CE的流出物直接经过氧化铟锡表面,产生的ECL由靠近ITO电极平面背面的光纤接收。该装置用于检测脯氨酸,线性范围为2~500 umol/L,检测分辨率达1umol/L。

LDH,乳酸盐脱氢酶;Lac. L-乳酸盐;Pyr. 丙酮酸盐;NAD. B-烟碱腺嘌噙二核苷酸;

NADH. B-烟碱腺嘌呤二核苷酸;还原态;DHB. 二羟苯甲醇

Leca等设计了一套基于鲁米诺的电致化学发光检测系统用于检测维生素B复合体。该体系采用石墨表面印刷电极作为工作电极,电极用丝网印刷技术制成,电极尺寸为6um,可重复使用,非常适用于微检测系统。由于丝网印刷技术用于电极制作费用远低于光刻,制作的电极尺寸已经达到um数量级,且可供生产电极的材料品种繁多,易于集成化。设计了一种全新的印刷电极,将石墨与L-乳酸盐、NAD+、 羟乙基纤维素、乙烯乙二醇和电子传输介质3,4-二羟基苯甲苯混合制成印刷墨水印刷工作电极,用以检测乳酸盐脱氢酶。

由图可看出所有反应均发生在电极层内部,被测的乳酸盐脱氢酶通过渗透作用到达电极内部参与反应,用该电极系统检测乳酸盐脱氢酶的线性范围最大达到 500U/L,分辨率为50 U/L。虽然这种印刷电极制作方法正处于初级阶段,线性范围和分辨率还有待提高,但是它提出了一种新思路,这种思路大大简化了检测方法, 使它可能被应用在基于ECL和其它电化学方法的生物检测中,并获得较高的系统集成度。

三、展 望

电致化学发光检测技术应用到生物检测和分析中,为生物检测提供了一种全新的手段。由于这种方法具有精度高、应用范围广和易于集成等优点,使它将成为生物技术领域的一种主要检测方式。虽然ECL技术应用在生物技术上还存在一些问题(如稳定性等)需要解决,但只要通过技术上的改进,并与芯片等技术的发展相结合,它将会有更广泛的发展和使用空间。

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