Jurkat 细胞电转

Jurkat 细胞即人 T 淋巴细胞白血病细胞，是一种悬浮细胞，作为实验室常用的人类 T 细胞白血病细胞系，通常用于研究免疫生物学和癌症生物学相关的问题。

如研究急性 T 细胞白血病及 T 细胞信号传导、核糖核酸酶 P（RNase P）的 M1-RNA 等，但是由于其难转染的特性，通常采用适用性最广的电转方法来瞬时过表达某些基因。

Jurkat 细胞，质粒 DNA，减血清培养基，电转仪，离心机，移液枪，配套的电转杯，细胞培养板，细胞培养基

1）在电转质粒之前需要对培养的细胞进行计数。一般存活率在以上，每个样品取

1.0~1.2 × 10⁶ 用来进行电转。

2）预热减血清培养基，300 g 离心 5 min 收集细胞，离心结束去除旧培养基，用 1 ml 减血清培养基重悬细胞。

3）300 g 离心 5 min 去除上清，重复一次，用于漂洗细胞。

4）用 200 μl 减血清培养基重悬细胞，按照每 1 × 10⁶ 个细胞加入 1~1.5 μg 质粒的比例配置 200 μl 减血清培养基的质粒 DNA 溶液。

5）电转体系共 400 μl，由 200 μl 的 Opti-MEM 细胞悬液与 200 μL 质粒溶液轻弹混匀而成，转移至电转杯中，尽量不产生气泡（移液枪吹打时不要按下第二段以防止产生气泡）。

6）在细胞培养板中加入 6 mL 完全培养基并放入培养箱中进行预热，供电转完的细胞使用。

7）打开电转仪，并设置好相关参数：电压 Voltage-250 V；电容 Capacitance-950μF；电阻 Resistance-无穷大 Ω；电转杯电极间距 Cuventte-4 mm。

8）电转时调到合适的参数后，将电极杯按照正确的方向放入槽中，按下开始按钮即可。观察反馈的数据，一般对于 1 × 10⁶ 个细胞的 400 μl 电转体系来说，29 ms 和 248 V 的反馈参数较为正常。

9）电击结束后先按下 Home 键再关闭电转仪的电源。

10）电转结束后可以用肉眼看出一部分细胞当场死亡并汇集成絮状沉淀，可以用枪尖挑出这些沉淀，或将其贴在电极杯的杯壁上。

11）向电极杯中再加入 400 μl 的完全培养基，边加入边吹打，之后不要反复吸打。把杯中的未死亡的细胞吸出后加入到预热好的细胞培养板（6 ml 完全培养基）中进行恢复培养。

12）加入细胞培养板时应该移动枪头，上下左右均匀滴加保证混匀，加入之后不可以再吸打以防止对细胞造成损伤。

13）用倒置显微镜观察电转之后细胞的状态：呈灰色，不透亮，透光度较差，表面能看到穿孔，但依然保持圆形的轮廓。正常的细胞状态：圆形，透亮，透光度高，表面无穿孔。

14）记录开始培养的时间，将细胞培养板放入培养箱中进行培养。

15）次日对电转结束恢复培养的细胞进行第一次换液以去除死细胞，电转质粒结束后一般在 3~5d 可以进行后续检测。

a．电转质粒 1 h 后，细胞一般可以恢复活性，膜修复会完成。但因为质粒有毒性，膜修复完成后细胞也可能会因为质粒的毒性而死去。

b．次日可以明显的观察到培养液上层存在漂浮的絮状沉淀。这些多半是死细胞和一些碎屑构成的，他们的密度通常比活细胞小，可以通过低速离心转速 100 g 去上清的方法去除。

c．大部分瞬转的细胞，由于随着传代的进行质粒无法保留。所以在瞬转结束后 10 天后认为所有质粒就完全失效，不建议再使用该细胞进行表型实验。

采用无内毒素的质粒 DNA 和无抗生素的完全培养基可以提高转染效率和成活率。

A．电转后细胞成活率低：在电转前用活细胞染料测定细胞成活率，最好以上，另外恢复培养的时间里，可以采用无抗生素的完全培养基以减少细胞毒性。

B．电转效率低：尽量采用无内毒素质粒和无抗生素的完全培养基，电压从 200~300 V 的区间优化，操作轻柔。

C．Jurkat 细胞为悬浮生长，理想状态多为均匀的成团生长。