开发灵敏度高、重复性好的侧向层析诊断产品----第二部分：新方法带来的新挑战

从更多专业领域分析，适合定量诊断分析需要的新技术的开发。

侧向层析免疫诊断（LFIAs）作为一种稳定的技术适合在广泛、多样的POC或者现场使用。然而，该技术不能适用于要求非常灵敏、重复性好或者需要获得定量结果的情况。

在过去的一些年里，在制作侧向层析诊断产品方面出现了一系列新方法，使得该技术可以用于广泛、多样的更高要求的应用领域。这些革新的方法迫使对LFIAs制做原理产生新的关注，同时研究进行研究、生产所需要的资源，以便成为这个领域内成功的改革者。

本文分为两个系列篇，于六月期杂志开始登载。第一篇文章关注LFIAs行业中传统的生产技术和材料，讨论各因素造成的局限性，并且将克服这些局限性的一些方法做了概要，以便制作重复性好的诊断产品。下篇文章关注材料、信号标记试剂、读条仪和整个LFIA观念的新方向，可能开发出更定量化的，灵敏度更高的LFIA产品。伴随这些新方向而来的是一些新的行业挑战。

方向趋势 通过这些年重要的大量研发努力，已经发现了克服许多在传统侧向层析免疫诊断产品中材料和设计固有弱点的方法。使用传统的方法手段，对产品设计和生产过程做出仔细的观察，使其可能转化到生产，获得具有低水平信号变异系数（CVs）的侧向层析诊断产品。该诊断方法的灵敏度接近或优于相关竞争的技术。然而，制作具有好重复性和高灵敏度表现的LFIAs产品，可能需要在材料科学、标记技术和装置设计上作出相当大的改变。

材料科学 最初使用在LFIAs上的材料不是专为这个系统中设计的。硝酸纤维素膜、玻璃纤维、聚酯纤维、人造纤维和其他过滤介质都被调整用于这个产品，但是每种材料都表现出其固有的不均一性，在传统产品结构中影响了LFIAs的可重复性。新的材料需要比现有的材料在功能表现上有所改进。在诊断分析系统中表现出功能多样性的材料是合意的。新材料的应用为LFIA装置设计打开了全新 观念的大门。

标记物 传统使用胶体金、彩色微球或荧光乳胶干燥在标记物垫上作为微粒标记，由于其不稳定性和释放的不均一导致高的差异水平。由于生产扩大上的缺陷和由检测手段的局限性导致的信号丢失，这些标记物的灵敏度往往是有一定的局限性。在对三维空间材料（例如NC膜）的视觉检测中，仅仅能检测到大约膜表面10um深度的信号；在该系统中剩余的信号被丢失。

新标记物，与具有选择性的材料连接并且配有读条系统，能产生重大的性能改进，可做为已经在用的标记物的替代物。

装置设计和读条仪，装置设计革新保留了传统LFIA合意的部分，但尝试避免由于主要材料和制做过程产生的缺陷。许多的这类设计依靠读条仪配合。因此，他们需要多学科交叉研发，增加了产品的设计和研发周期的复杂性。

材料和装置设计 对于使用在侧向层析诊断产品中具有多重功能的叠层吸水材料，可能引入智能特性的东西，使制造过程更加复杂，同时增加了诊断产品的变化性。下一代侧向层析诊断产品要达到高重复性和高灵敏度的要求，需要关注开发使用在该类诊断产品中的新材料。这适合于整个诊断装置，而不仅仅是对于膜系统。

虽然在过去十年中做了一些革新的尝试，真正应用于LFIA材料的新方法，独特的反应表面和标记物垫材料，并不是很多。这些对于某些部分进行的尝试并不能满足市场需求。然而最近出现在市场上的几个革新似乎显示出一些被接受的情况。

考虑LFIAs材料选择时，设计者可能关注以下多种表现特性：

• 高度规则表面介质带来了优质线条品质

• 拥有一致膜孔径大小、厚度和蛋白结合能力的三维结构材料

• 在多种吸水速率下的正确毛细层析

• 在有可能情况下最轻薄化

• 在整个产品保质期保持好的流体流动特性，独立测试

• 在整个产品保质期保持毛细时间增加的低CVs值，独立测试

• 最小程度的金属污染

• 低荧光背景干扰

图1、 图示快速诊断研究， 使用Fusion 5的HCG诊断产品。Whatman (Florham Park, NJ)。(a) 0 秒， (b) 15 秒， (c) 1 分钟。

• 无干扰反应

• 储藏期间的稳定性

• 非易燃性

• 低成本

• 共价联结的活性

• 多功能性，例如，单一材料作为标记垫、样品垫、反应载体、分离介质和吸水介质。

几种新材料和相关的设计方向是在这些基本原则下进行研发的，虽然仍未有能完全实现所有列出描述的产品进入市场。下列一些产品就是说明。

革新的材料，一种符合上述一些描述的材料被研发，这就是Whatman(Florh am Park, NJ)公司的Fusion 5材料。该大孔径、单层材料是亲水的和本来就不能被蛋白结合的。这种材料意义在于单一材料实现了用于传统侧向层析装置上所有材料的功能。它可以作为样品垫、胶体金垫、膜和吸水纸。

由于它不能被蛋白结合，Fusion 5不适合传统的将测试线和控制线喷点到介质层的使用方法。一种策略被作为代替办法，有点象在流水中放一个大石头。大直径珠粒（大约2um）被标记到测试线和控制线蛋白上，然后被喷点到材料的适当位置。大珠粒被固定在材料中，并形成测试线和控制线区域。当样本和标记抗体结合复合物层析通过所谓的“大石头”时，在这个区域出现了蛋白结合和信号表现。

该系统固有的开放孔径意味着检测能被极其快速的完成，表现出阴性和阳性结果。速度或者反应时间对于LFIAs是重要的，但在多数情况下它与灵敏度构成反相关。在Fusion5中使用珠粒方法极大地克服了这个问题，且拥有低背景值和增

图2 微柱结构的4CastChip，Amic AB (Uppsala, Sweden)产品。

加了配体结合的表面积。

将Fusion 5应用于LFIA产品，能使生产过程变得非常简单。LFIAs标准生

产中的基本步骤，浸泡、干燥和层叠，都被省略。使用该材料必需满足一个要求，相关的大颗粒在测试线和控制线区域内能沉积形成线条，这可能是技术难点。然而，该沉积过程通过使用非接触和接触两种方式喷点，被证明具有技术可行性。

微柱层面 另一种新的分析和材料设计方向是Amic AB (Uppsala, Sweden)的4CastChip.该公司研发出一种诊断分析层面，其在塑料表面分布有高度规则的微柱阵列（见图2）。

图3 Amic装置流道的规则柱结构

图4 肌钙蛋白I（TnI）数据，反应发生在Amic 4CastChip上。用 Molecular Devices Corp. (Sunnyvale, CA) 的GenePix扫描仪获得量化数据

4CastChip中的微柱表面被右旋糖苷修饰为亲水性的，且驱动流道内的样品和试剂毛细层析。同样，微柱为测试线和控制线处的捕获配体提供了一个生物适应性好的表面。该材料与标准的NC膜材料相比具有高度规则性（见图3）。象Fusion 5一样，Amic公司的装置提供了多种功能，微柱构成的流道能作为加样区、反应表面和吸水垫。

在芯片表面上，将蛋白结合到该材料的表面是通过氨基和醛基间的共价吸附力。蛋白被喷点到表面，然后在潮湿环境中，短时间内发生联接反应。该材料能应用于发生高灵敏反应的分析产品，其使用荧光标记，且与读条系统连接时能测出明确的灵敏度值（见图4）。

在芯片表面上，将蛋白结合到该材料的表面是通过氨基和醛基间的共价吸附力。蛋白被喷点到表面，然后在潮湿环境中，短时间内发生联接反应。该材料能应用于发生高灵敏反应的分析产品，其使用荧光标记，且与读条系统连接时能测出明确的灵敏度值（见图4）。

与Fusion 5一样，在生产期间，该装置有可能减少生产流程中的一些步骤。同时，它需要将蛋白连续喷点到离散的材料表面，该工作仅能通过非接触喷点技术来完成。芯片要求单片生产操作，从生产过程的观点来看可能是一个弱点，反之象NC膜类的材料可以实现滚轴式的生产。喷点方式必须具有高度的规则性、

重复性和精细控制，以便确保线宽度是一致的（见图5）。

4CastChip表现出LFIA层构思路上的转变，作为一种有效的两维空间层构，不是由离散的孔构成的。然而，该装置表现出真实的毛细能力，有极其规则的亲水表面和产生视觉上可接受的灵敏度线条（在系统测试时间内，与已知的应用于临床和POC系统产品中的材料相比）。该材料自身具有高度稳定性和能保持蛋白长期结合在稳定的位置上。所以，它符合在本文开头列出的理想装置的很多标准。

图5 BioDot公司(Irvine, CA) 的AD 3200型喷涂仪。

标记和读条系统 几种类型标记颗粒技术被使用在LFIA系统中。对多种标记方法进行选择，决定了可达到的灵敏度和简化了标记生产，并且使用读条系统连接测试条是必要的。如果读条仪是必需的，使用的标记方法将决定读条仪的类型。标准系统利用胶体金或乳胶颗粒包含可视或荧光染料进行标记。

分析系统决定了一些缺陷的影响方式。例如，当一种可视标记被评估时，使用眼睛或读条仪判断，显现的信号仅仅是膜顶部10um内的表现。捕获信号中的重要部分因读条仪的透视性而丢失。同时，侧向层析分析不允许信号放大，由于考虑到设计和使用的简便性，多步分析方法一般不用在该系统。

然而，一些颗粒标记的新方法在近年被引入。包括顺磁粒子（PMPs），被Magna BioSciences (San Diego)使用在磁性免疫层析测试技术（MICT）；且荧光标记的革新，被Cibitest GmbH (Neu-Ulm, Germany)应用于荧光标记免疫试纸条技术（FLORIDA）研发。

PMP技术 Magna Bioscience的MICT技术以前在IVD技术杂志上有所报道。1摘要，在LFIA系统中使用顺磁粒子的优点如下：

• PMPs是一种直接代替颜色或荧光标记胶体颗粒的技术。

• 标记化学成熟并且可标准化。

• 试剂稳定

• 研发产品信号稳定

• 生物材料上磁背景低

• 磁区域不受视觉屏障阻碍；因此，对膜有污染或染色的样品测试能被进行，且测试和控制线不一定要是可视的。

• 读条仪能检测在介质底层内的所有信号

图6 心肌肌钙蛋白I(cTnI)数据，使用 Magna BioSciences system进行研究。(a) cTnI标准曲线显示从0 到10 ng/ml的线性关系；(b)从0 to 1 ng/ml曲线的放大。

最新消息显示，在肉眼和视觉读条仪可检测空间结构以下的信号颗粒捕获问题已被克服。高利用率的信号强度能被转化成重要的检测灵敏度数据。

MAR系统被证明在多种系统中都具有可行性。该系统被证明在多种分析系统和材料中具有高灵敏度和可应用性。

荧光团技术 另一个应用于侧向层析分析的敏感标记和读条方法，Cibitest的FLORIDA技术，作为信号产生试剂，所有的荧光团以高密度形式标记在载体分子上（见图7）。荧光团和载体复合物被标记到使用在分析诊断中的特异性蛋白上。这意味着荧光团与蛋白的连接率是非常高的。因此，信号强度比标准的抗体直接连荧光团方法要高。

该技术额外的优点在于标记的荧光在可见波长范围内，使得信号的产生和检测极其的简单，而标准的荧光团标记检测需要一个复杂的读条仪。Cibitest装置仅要求一盏激发灯，判读能被肉眼完成。因此高灵敏度分析能被实现，虽然信号的量化上还存在问题。

图7、 产生在测试和控制线上的信号，用 Cibitest GmbH (Neu-Ulm, Germany)的FLORIDA荧光技术。

荧光读条技术 对于任何需要读条系统的LFIA研发来说，主要问题之一是必须连接到一个合适的系统上。对于一些检测研发人员而言，与荧光读条仪连接会有问题，因为在试纸条研发完成之前就要将大量的预先投资都放到专利和读条仪的研发上。市场中缺乏适合侧向层析诊断的低成本、易使用的读条仪，该读条仪要能快速转化成可用产品。

表I HIV混合浓度平板测试结果，使用 HIV 1/2 荧光 LFIA 从the One Step One Solution program (OSOS)和 the Embedded Systems Engineering 手持荧光传感器。 检出值被证实，使用平均5个被证实的HIV1/2阴性样本和3个标准背离。

Embedded Systems Engineering GmbH (ESE; Stockach, Germany)制造的荧光分析读条仪尝试去解决这个问题。ESE制造了一个微型的共焦光学传感器（见图8）能适用于多种结构的综合性考虑，包括手持式和实验室式单位（见图9）。该传感器能快速改进，使用在多种类中的任何荧光标记产品上。该系统在多种测试系统中表现出高灵敏度和大动态范围（见表I和II）。该类装置和服务的实用性解决了LFIA开发者的工具包中一个关键的开发障碍。

多学科交叉平台研发

表II HIV血清转化平板测试结果，用OSOS HIV 1/2荧光LFIA和ESE手持荧光传感器测定。检出值被证实，使用平均5个被证实的HIV1/2阴性样本和3个标准背离。 研发高灵敏度和高重复性的定量LIFAs产品的主要面临挑战之一是该类检测系统要求更多的多学科交叉步骤，比使用传统技术制作标准的侧向层析分析产品。需要广泛的学科研究投入，包括材料科学、化学、生物学、光学、软件和硬件工程，同时还要求过程设计、设备设计和项目管理。专门技术要求整合所有的这些原理并确保制作出可行的产品，可能会遇到困难，尤其是对于小公司。

图8、 小型荧光传感器模型， Embedded Systems Engineering GmbH (Stockach, Germany)。

图9、手持荧光LFIA读条仪

然而，开发精确定量LFIAs产品要求更多的合作。需要保证能够使相互的思考、工艺和专门技术驱动这个过程，就象与BioDot Inc. (Irvine, CA)有合作关系的Diagnostic Consulting Network (Carlsbad, CA)提供的一步一解决程序（OSOS）。OSOS程序设计是为研究者提供服务，在研究过程中帮助他们评估某些新的相关的ICT分析技术；以提供读条技术、新材料和新标记技术构成的网络结构；并且在各种体系中评估这些艺术性技术的有效性。也包括一个教学性组成部分，通过该公司能直接学到基本的LFIAs方法和与前沿发展水平保持同步。诊断工业

中的微矩阵和微柱体开发多依靠协同合作，研发和生产中需要多学科交叉。在过去十年中，它获得了可观的投资。采用多学科交叉分析研究程序组合外包的概念，可能使他们获得成功，尤其是对小公司而言。

结论

这些新技术进行的严格测试将被取信市场，例如有效性、适合应用环境和终端客户、成本、产品的可生产性和使用明确专利的有效性。该技术将继续改进直到被完全的新技术代替，主要决定因素是被证明具有实用性和广阔的应用空间。

2005 U.S.临床诊断POC市场估计在$83亿，大约$30亿POC测试产品是与血糖监控无关。2产生在广泛地使用的POC测试中的重大潜在利润提供了LFIA积极的发展动力，但也更好的体现出其巨大的市场性。

同时临床POC市场仅仅是该技术的冰山一角。象畜牧兽医诊断、食品微生物、农业、水产业、环境、工业健康和安全，所有的都显示市场增长的信号和有更大的潜力。为满足这个领域内许多新应用方向的需求，可能需要将本文讨论的方法类型工业化。

参考文献

1、 RT LaBorde and B O’Farrell, “Paramagnetic Particle Detection in Lateral-Flow Assays,” IVD Technology 8, no. 3 (2002): 36–41.

2、 Clinica, Complete Guide to the Diagnostic Market 2004–2009 (London: PJB Publications, 2003)。

Brendan O’Farrell, PhD, Diagnostic Consulting Network (Irvine, CA) 负责人an BioDot Inc技术研发部副总。 Jeff Bauer 也是 Diagnostic Consulting Network 负责人之一，且是 BioDot Inc的首席科学家。 作者联络方式分别为： bofarrell@dcndx.com 和 jbauer@dcndx.com

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