开发灵敏度高、重复性好的侧向层析诊断产品---第一部分：对于老问题的新方法

对材料进行选择和生产工艺采用新方法能改善诊断产品性能。

侧向层析诊断技术作为一种稳定和实用的技术适合在多样的POC或者现场使用。然而，该技术不能广泛适用于要求非常灵敏、重复性好或者需要获得定量结果的情况。近年，在各种非传统市场领域对该技术的兴趣与日俱增。驱动侧向层析技术复兴的综合因素包括：现有技术面临的专利压力，另外新技术拥有好的灵敏度、可重复性和定量性或者目标结果的可记录性；为适应POC或者现场使用的市场要求，要求投入市场周期短且投资合理。

图1 侧向层析免疫诊断技术作为POC或现场应用的优势

侧向层析免疫诊断（LFIA）系统的优势众所周知（见图1）。在这些优势中最重要的是LFIAs作为一种适用POC或者现场使用的技术，具有投资小、进入市场快的特点，且能被适用于更广阔的应用领域。这些优点是其他公认的目前正在发展的POC技术所不能比拟的，包括传感器和芯片技术。

侧向层析诊断技术已经在一些市场领域内得到引入和发展（见图2）。然而，生产适合这些领域需要的侧向层析诊断产品仍然面临挑战。随着应用范围的扩展，增加了对技术的要求，要求改善灵敏度、可重复性和生产能力。例如，要求定量化和客观化的读条/记录技术能与实验室信息系统连接。除了改进材料、分析技术、读条技术和生产工艺外，侧向层析诊断发展也需要更多的学科交叉。

图2 侧向层析免疫诊断技术在POC和现场应用的市场分。

近年，适合这些要求的生产侧向层析诊断试纸的新方法不断涌现。每个新方法都是IVD厂家在这类生产技术基本原理上如何进行新突破的结果。

这是两部系列中的第一篇文章，阐述了研究和生产高灵敏、好重复性的LFIAs产品存在的挑战，且概述了克服传统方法局限性的革新。该文关注传统生

产技术和材料，不仅讨论每个条件的限制且谈到克服这些局限性的具体步骤。

硝酸纤维素膜（译者注：以下简称NC膜） 图3描绘了一个传统侧向层析测试条的常规生产过程。使用在该系统和行业内的生产材料和工艺流程基本保持不变。

NC膜材料被大多数侧向层析诊断产品系统选用。虽然也有市场上的其他材料被尝试（例如：尼龙膜和PVDF膜），这些尝试仅获得有限的成功。有限成功的原因包括成本、使用局限、新的化学和工艺的知识要求和使用NC膜已知经验的惯性。

虽然NC膜也不是LFIAs中分析用膜的理想材料，但它具有的某些属性使得它可以在该领域内使用。这些属性是成本低、毛细流动稳定、高蛋白结合能力、处理相对容易（有聚酯背衬的膜）和拥有不同的吸水速率和表面活性组分的产品。

尽管有这些积极的特性，NC膜也有许多的缺陷。这些缺陷包括，批内批间性能重复性差、保质期问题、易燃性和易损性（无背衬膜），和由于环境引起变化的属性，例如湿度。

图4、BIODOT公司的XYZ3050平台配有 BioJet Quanti 3000 和AirJet Quanti 3000喷头

图5 对比使用接触式和非接触式喷点方法，喷点到膜上的蛋白线条宽度。

对于NC膜的这些缺陷，诊断开发者和IVD生产商要花费相当多的时间和精力在克服材料内在问题的化学配方优化上。他们也优化了生产工艺保证产品在整个保质期内性能稳定。仔细控制关键步骤，喷点、浸泡和烘干过程，注意对膜的化学和生物处理，来预防发生额外的变化，得到完美的成品。

膜上的试剂喷点 对于标准的LFIAs产品，NC膜上至少有一根测试线和一根控制线。该过程使用喷头喷点一定量液体到单位长度膜上。IVD生产商使用两种喷点方式：接触式和非接触式。

接触喷点系统中，喷头划过膜表面，同时泵推动一定量的液体从喷头处释放到表面上。该系统是简易和实惠的。然而，该过程与膜表面接触，会导致划痕。另外，由于液体进入膜的过程不仅依靠膜表面与喷头的接触，而且与膜的吸液能力的一致性有关，使得线条宽度会发生变化。该变化可能是读数分析时主要影响因素，因为读条仪获得的结果与线的宽度相关。这使得检测结果不一致且系统完全不能定量。

另一种选择是非接触式喷点系统，例如BioDot Inc.(Irvine, CA)的BioJetQuanti 3000系统（见图4）。BioJet使用电磁阀连接高精度步进泵，喷点液体颗粒到膜上且以紧密的交迭点构成连续的线条。试剂在接触点处被吸收入膜内，膜表面与喷头的接触影响因素被排除。非接触喷点的线条宽度比接触喷点更均一。使用接触和非接触式喷头喷点的线条宽度进行比较（见图5）。

图6 BIODOT公司的RTR4500连续喷点系统中的连续生产成像与坏段标识系统

连续化生产工艺方法更好控制，因为喷点过程是与成像系统连接，能检查喷点线条的质量同时标记任何坏的部分（见图6）。连续喷点设备能喷点出一致的线条宽度，同时成像系统能实时评估线条质量。

膜封闭 在侧向层析系统中，膜封闭具有多种功能，包括：

防治和减少样品或标记物对捕获线和整个膜的非特异性吸附。封闭也被用于控制层析速率和稳定测试、控制线蛋白。封闭过程包括将制作试纸用膜浸泡在由蛋白、表面活性剂和聚合物组成的水溶液中。然后将膜拿出、喷点、干燥。

封闭过程有批处理和连续两种模式，使用连续的处理工艺使浸泡和烘干具有最好的一致性。这两个步骤确保了最佳产品性能和可重复性。烘制批次间由于采用了不同烘干方式造成产品性能的差异，能够通过使用连续干燥系统来解决。例如，干燥塔以相同的方式处理每个步骤，烘制批次间对比验证容易，不受温度和湿度的差异影响，且能高效工作。

图7 在RTR4500中质量控制成像系统输出数据。运行喷点50m长，50mm/sec，1mg/ml人 IgG，0.8ul/cm在NC膜上。

连续浸泡和干燥使处理材料更加均一，原因如下：在浸泡槽内单位长度材料的处理时间一致；干燥塔中单位长度垫的干燥时间一致；且减少了槽内批次溶质残余不均的影响，连续浸泡槽连续地补液并混合，使得溶液浓度保持一致。

如使用的材料需要封闭NC膜，将会是一种不幸的结果。在产品保质期内封闭工艺的作用是防止产品发生变异，这将增加生产成本和复杂性。

图8a和8b论证了封闭对产品初期和结束时性能的影响。该图对比了浸泡和非浸泡封闭金标产品的定量性能、视觉读条情况。首先，诊断试纸被封闭和使用，它显示出更低的信号灵敏度和更高的变异系数（CV），结论为封闭不适合应用在诊断试纸。然而，当检查移除封闭步骤对系统稳定性的影响时，非封闭的膜对诊断产品的重大影响非常明确，原因是干燥包装储藏后诊断反应时间发生了变化。

图8（a）封闭和未封闭膜在变异系数和线强度方面的比较。（b）封闭对膜层析速率稳定性的影响。柱条表示诊断试剂流动通过25mm膜的时间。DB=浸泡封闭，UB=未封闭。

标记物垫：玻璃纤维、聚酯膜和人造纤维 在典型的诊断系统中，标记物垫承载标记物、保证其在产品保质期内的稳定性和有效的、重复性好的释放标记物。事实上，标记物喷点、干燥和从材料上释放的差异是诊断试纸性能差异的主要来源，表现为批内和批间的CVs值。标记垫的释放快慢也是重要的因素，必须保证释放的一致性。

由于使用材料的属性，标记物垫应该经预处理，确保适宜的释放和稳定性能。垫的处理是浸泡在由蛋白、表面活性剂和聚合物构成的水溶液中，然后干燥。类似膜的浸泡和干燥处理，该过程能被应用在手动批次操作模式和连续化操作模式，后者能使整个批次材料更加均一。

表I 在试纸测试时，不同标记物垫上顺磁粒子释放的百分比。（n=10）

将标记物添加到已处理垫上的方法要根据测试条的最终性能来评估。以下两个方法被用来添加标记物：浸泡，将已处理垫浸泡到标记物溶液中；使用定量的非接触喷点方法喷点，例如使用BioDot的AirJet Quanti 3000喷头（见图4）。

定量喷点标记物到标记物垫上比浸泡工艺有更好的吸附均一性。喷点标记物也影响了标记物从垫上释放的均一性和效果。另外，喷点标记物去除了浸泡期间发生的前处理溶液洗脱处理过程。

表I数据论证了在两种不同标记物垫上使用浸泡和喷点标记物的差异比较。在该实验中，一定规格的顺磁性颗粒被用于每个垫，无论是浸泡法还是喷点法，每个垫含有总量相等的颗粒。干燥过的垫装配形成LFIA试纸，使用150ul缓冲液测试。标记物释放的测定是通过光谱分析诱导连接血浆的铁离子总数进行的。

图9、（a）样品释放垫上分析物释放比较。（b）两种样品释放垫材料释放比较。

使用浸泡和喷点两个不同标记物处理方式，标记物从垫上释放情况有明显差异。标记物喷点法比等量浸泡法，集中于一个更小区域内，而与标记物垫的材料关系不大，且颗粒能更好的从材料上释放。

数据进一步证明标记物定量喷点能改善测试条的CVs值（见表II）。该实

验是用免疫夹心法测试血清中标记物。对应喷点使用BioDot的AirJet Quanti 3000，乳胶颗粒喷点多用浸泡方式。规则的标记物使每个测试条都有同样的量。该结果通过光学读条仪来测试。通过标记物喷点改善是该诊断法在临床应用范围的CVs值。

表II 使用不同标记物喷点方法在血清标记物测定中的数据比较。

另外对于标记体系，选择标记物和标记方法是重要的。对于进行定量分析能力而言，共价耦联是重要的，对比被动吸附法，它在配体和颗粒间具有更稳定的联接。新的标记和读条方法将在本系列的第二篇文章中进一步讨论。

样品垫 纤维素、玻璃纤维、聚酯膜和其他的过滤介质在LFIAs中，样品垫接受样品和处理样品使其与试纸兼容。该过程不能对分析物质产生影响，且对于诊断试纸具有高效的和高重复性的释放性能。材料选择可能影响分析性能，由于很多可用材料和它们所含成分类型的不均一性。如果需要，垫前处理方法必须仔细设计，避免缓冲液在干燥中浓度倾斜和边缘效应影响。在均一地处理垫时最好使用连续化方式。

选择合适样品垫材料的重要性，通过检测孕酮竞争定量诊断中的CV值和线性关系，证明了改变材料对诊断试纸性能的影响（见图9a和9b）。该系统中两个不同的样品垫材料被评估。两个垫分别是纤维材料和其他不能判别的材料。每个垫都经缓冲液处理，保证PH和确保分析物不被结合，且添加聚合物稳定流速。结果通过BioDot试纸条读条仪读取，该读条仪使用CCD成像捕获和计算线密度。

样品垫A具有更好的分析物释放性能，改善了CVs，尤其是在曲线末段，和在整个分析范围内的良好线性关系。为该系统选择错误的样品垫材料对生产合格定量诊断产品会有影响。

层叠、切割和包装 在侧向层析诊断中使用不同功能的多种材料，意味着需要将单个组分层叠到背板材料上。传统上，无读条仪配合的侧向层析试纸使用手工层叠法，层叠过程有很大的差异。该差异导致测试条间叠合位置和卡中最后线条位置的差异。虽然在许多要求不高的应用中某些差异是可接受的，但叠合位置的差异导致了试纸条质量的差异。

图10 BIODOT公司的LM6000连续层叠系统。

然而，在一些高要求的应用中，跑板时间和流动结构的差异对分析性能有很大的影响。尤其是在配合读条系统的情况下，横跨整个试纸宽度的喷点线条均一，跑板速度达到要求，组装盒内线条位置一定，即被认为是好的测试条。这些因素对层叠工艺、切条工艺和装盒工艺有较高要求。自动化操作是缩小工艺差异的关键。使用带有成像系统和材料边缘传感器的连续化层叠设备，象在切条和装配工艺中一样的传感技术，为这些应用领域生产出合适差异的部件（见图10）。

结论 由于这些技术的存在，标准的侧向层析诊断产品能做到高灵敏、重复性好和经济化生产，适合在很大范围领域内应用，在这些领域内很少有其他的诊断方式能与其竞争。通过选择合适的材料、生产设备和生产工艺技术，IVD生产商能生产出符合严格性能标准的诊断产品，所以对这些选择需要格外关注。

为了达到更高的应用水平，要求革新和方法学上的更好应用。一些新颖的方法用于材料学设计、生产工艺设计、分析设计、检测和样本处理技术，这些方法使得该技术性能得到明显改善。关键是实现这些改变，同时保证侧向层析诊断产品的性能和在POC和现场检测的基本应用。

该系列的第二篇文章将讨论材料和生产工艺的标准方法选择，关注新方法对诊断产品性能的改善，同时讨论其产生的工艺挑战。

作者简介：Brendan O’Farrell, PhD, Diagnostic Consulting Network (Irvine, CA) 负责人an BioDot Inc技术研发部副总。 Jeff Bauer 也是 Diagnostic Consulting Network 负责人之一，且是 BioDot Inc的首席科学家。

作者联络方式分别为： bofarrell@dcndx.com and jbauer@dcndx.com

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