可溶性抗原的制备及鉴定

蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸等均为可溶性抗原，它们有相当部分来源于组织和细胞，成分复杂。制备这类免疫原时，首先须将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的蛋白或其他抗原，提纯的抗原需鉴定后才能用做免疫原。

一、组织匀浆的制备

用于制备免疫原的材料必须是新鲜或低温保存的。材料获得后立即去除包膜或结缔组织，脏器应进行灌洗，去除血管内残留的血液，用含0.5g/L NaN3的生理盐水洗去血迹及污物；在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成0.3～0.5cm3小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机筒内制成组织匀浆。组织匀浆经3000r/min离心10min后，上清液作为提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前还必须进行离心去除细胞碎片及微小的组织。

二、细胞破碎

提取细胞的可溶性抗原，需将细胞破碎。根据细胞类型不同，选择破碎的方法也有一定的差异，现介绍几种常用的细胞破碎方法。

1、酶处理法

溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等在一定的条件能消化细菌和组织细胞。如溶菌酶对革兰阳性菌的细胞壁有溶菌作用。酶处理法适用于多种微生物细胞的溶解，该方法具有作用条件温和、内含物成分不易受到破坏、细胞壁损坏程度可以控制等特点。

2、冻融法

细胞主要因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度突然改变而破坏。其方法是将破碎的细胞置-15～-20℃冰箱内完全冻结，然后从冰箱取出，让其在30～37℃中缓慢融化。如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。

3、超声破碎法

这是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的一种方法。由于超声波发生时的空腔作用（cavitation），使液体局部减压，引发液体内部流动，在漩涡生成与消失时，产生很大的压力而使细胞破碎。超声波所使用的频率从1～20kHz不等。进行超声破碎时，需间歇进行，避免长时间超声产热，导致抗原破坏。也可将超声粉碎的细胞置于冰浴降温。超声破碎细胞，方法简单，重复性较好，且节省时间。微生物和组织细胞的破碎，均可采用此方法。

4、表面活性剂处理法

在适当的温度、pH及低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，通过细胞膜的通透性改变使细胞溶解。常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠（SDS阳离子型），新洁尔灭，Triton X-100等。如将大肠杆菌湿菌体1g，加入2%浓度的Triton X-100作用60min，可使绝大多数大肠杆菌的菌体裂解。此方法作用比较温和。在提取核酸时，常用此法破碎细胞。

三、蛋白质的提纯

蛋白质纯化方法属于生物化学技术，本章只作较简要介绍。

1、超速离心法

此法分离和纯化抗原的原理是利用各颗粒在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度梯度层内，达到彼此分离的目的。常用的密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl等。

用超速离心或梯度密度离心分离和纯化抗原时，除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来，故只用于少数大分子抗原的分离，如IgM、C1q，甲状腺球蛋白等，以及一些比重较轻的抗原物质如载脂蛋白A、B等。多数的中、小分子量蛋白质采用此种方法很难纯化。

2、选择性沉淀法

其原理多根据各蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。最常用的方法是盐析沉淀法。

盐析法的原理

蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。

同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白分离出来。最常用的盐溶液是33%～50%饱和度的硫酸铵。盐析法简单方便，可用于蛋白质抗原的粗提，丙种球蛋白的提取，蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原纯度不高，只适用抗原的初步纯化。

3、凝胶层析法

凝胶层析是利用分子筛作用对蛋白质进行分离。凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经过适当的溶液平衡后，装入层析柱。一种含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时，大分子物质不易进入凝胶颗粒的微孔，只能分布于颗粒之间，因此在洗脱时向下移动的速度较快，最先被洗脱。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，洗脱时向下移动的速度较慢，随后被洗脱。因此，蛋白质分子按分子大小被分离。

4、离子交换层析法

离子交换层析的原理是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质的等电点不同，所带的电荷量不同，与纤维素（或凝胶）结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置，从而使吸附的蛋白与离子交换剂解离。

在离子交换色谱技术中常用的离子交换剂有以下几种

①具有离子交换基团的纤维素，如羧甲基（CM）纤维素、DEAE-纤维素

②具有离子交换基团的交联葡聚糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺

③凝胶合成的高度交联树脂。

5、亲和层析

亲和层析是利用生物大分子的生物特异性，即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。例如抗原和抗体、酶和酶抑制剂（或配体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体、IgG和葡萄球菌蛋白A（SPA）等物质间具有一种特殊的亲和力。例如提纯IgG时，可将SPA吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的IgG可与SPA发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH值，IgG与固相基质上的SPA解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的IgG。

亲和层析法纯化蛋白质抗原的主要优点是纯度高，简单快捷，但成本较贵。

四、核酸抗原的制备

核酸分子具有免疫原性，可用于免疫原制备抗体。提取核酸的主要步骤是先将细胞破碎使核酸从细胞中游离出来，再用酚和氯仿抽提以去除蛋白质，最后用乙醇沉淀核酸。

五、脂多糖抗原的制备

脂多糖（LPS）是革兰氏阳性菌细胞壁的重要成分，有多种生物学效应。通常采用苯酚法提取LPS。具体方法是：将干燥的菌体（或数量相当的湿菌体）在水中混匀，加热至65～68℃，加入等体积预温的苯酚，并激烈搅匀，再加热5min，立即用冰冷水急剧冷却降低至10℃以下，3000 rpm离心30min，使其分为两层。上层为水层，下层为酚层，菌体残渣于底部。吸取水层（含LPS），经透析除酚、浓缩、超速离心后，脂多糖位于上层沉淀的透明胶状部分，取出悬于水中，再进行离心，即可获得纯化的LPS样品。

六、纯化抗原的鉴定

为获得好的免疫效果，抗原纯化后应进行鉴定才能用于动物免疫，抗原的鉴定主要包括以下几个方面：

1、含量检测

蛋白含量的测定最准确的方法是凯氏定氮法，但由于要求有精密设备，故不适合一般实验室。一般实验室均采用分光光度计测量法。该法首先测定280nm和260nm的吸光度（A），再用经验公式计算蛋白含量。

蛋白含量（mg/ml）=A280×1.45-A260×0.74。

另外蛋白含量也可采用福林酚法，具体操作见临床生化技术。

2、分子量的鉴定

测定分子量一般采用SDS-PAGE电泳法，详见临床生化技术。

3、纯度鉴定

常采用区带电泳法鉴定，详见临床生化技术。

4、免疫活性鉴定

常采用双向琼脂扩散试验。