间接凝集实验及致敏红细胞制备方法

将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。

一、 间接血球凝集实验

间接血球凝集实验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的。将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面，此时红血球即称为“致敏红血球”。这种致敏的红血球具有细菌的抗原性，与相应的抗血清相遇可产生凝集现象。

间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。

（一）材料

1、抗原—伤寒杆菌O抗原

2、免疫血清：伤寒杆菌O901免疫兔血清

3、25%绵羊红血球悬液，生理盐水，试管吸管等

（二）方法

1、“O”抗原的制备：将每毫升100亿的伤寒杆菌“O”菌悬液，置100℃水浴中2小时，离心沉淀吸取上清夜，分装无菌试管，放4℃冰箱备用。

2、致敏红血球悬液制备：取一定稀释度的抗原加等量2.5%绵羊红血球悬液，混合后放37℃水浴箱中，每隔15分钟取出振摇一次，共经2小时。然后取出，用生理盐水洗涤3次，而配制成0.5%悬液即成。

3、实验步骤：

（1）小试管9只标好号码于试管架上。

（2）第1管加入0.9毫升生理盐水，其余各管各加入0.5毫升。

（3）以吸管吸取已加热灭菌的免疫血清0.1毫升加入第1管，混匀后吸取0.5毫升注入第2管，同样第2管的血清与盐水混匀后吸取0.5毫升注入第3管。如此依次稀释直至第8管。自第8管吸出0.5毫升弃去。第9管不加血清作对照。

（4）于每管加入0.5毫升已经致敏的0.5%绵羊红血球悬液，混匀后放入37℃水浴中2小时后观察结果。凡最高血清稀释度的免疫血清试管中呈现完全血凝者，即为该血清的间接血清效价。

二、致敏红细胞的制备

（一）直接法

1、取10%双醛固定的红细胞悬液1ml，离心沉淀后，将压积细胞悬于0.1mol/L、pH4.0醋酸缓冲液5ml中。

2、预温后加含适量致敏抗体的醋酸缓冲液5ml，混匀，放37℃20~30min或24℃ 60~75min，其间摇动数次，但不宜剧烈和频繁摇动，以免引起自凝。

3、最后用0.11mol、pH7.2 PB洗3次。

4、洗涤后的致敏红细胞用保存液配成10%悬液4℃保存或冻干。临用前，用实验中所用血清稀释液配成0.5%浓度。

（二）间接法1：鞣酸法

1、取压积红细胞0.5ml，加0.15mol/L pH7.2 PB至100ml，加入0.05g/L鞣酸液100ml，混匀，放置37℃ 10min。

2、离心沉淀后，用同一缓冲液洗3次，重悬于生理盐水100ml中。加等量含适量抗原（或抗体）的同一缓冲液，置室温致敏10min。

3、离心沉淀用1：250稀释的正常家兔血清洗涤后，制成0.5%的致敏红细胞悬液。

（三）间接法2：戊二醛一步法

1、将绵羊或人“O”型红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗3次，取沉积红细胞0.1ml，加至含0.1mg抗原或抗体的PB（用于抗原）或pH4.0醋酸缓冲液（用于抗体）2ml中，电磁搅拌下缓慢滴加2.5%戊二醛0.25ml。

2、继续于室温搅拌2h后，用PB洗3次，然后用稀释液20ml配成0.5%致敏红细胞悬液。

（四）间接法3：戊二醛二步法

1、将绵羊红细胞用0.11mol/L pH7.2 PB洗5次，用1%戊二醛配成2%悬液，于4℃醛化30min。

2、醛化完毕，用PB洗5次，用pH4.0醋酸缓冲液（或pH7.2 PB）配成5%悬液。取此悬液10份，加入6份用pH7.2 PB配制的抗原溶液（抗原浓度预测定）或用pH4.0醋酸缓冲液配制的抗体溶液（IgG约200μg/ml）。

3、37℃水浴1h，时时摇动，取出后用PB洗2次，用稀释液配成0.5~1%悬液。醛化红细胞如不立即致敏，4℃可保存2个半月，致敏红细胞可保存3个月。

（五）间接法4：CrCl3法

1、取洗过5次的2%红细胞悬液10ml，加入0.2ml抗原（或抗体）溶液，混合后在电磁搅拌下缓慢滴入最适浓度的CrCl3溶液，置室温5min，其间摇动1~2次。

2、加入等体积PB中止反应，用PB洗2次后配成0.5%~0.75%细胞悬液。

（六）间接法5：双偶氮联苯胺（BDB）法

1、取含适量抗原或抗体的0.15mol/L pH7.2 PB 3ml，加50%醛化固定的红细胞0.1ml，混匀。

2、加BDB应用液1ml，混匀放室温15min，4℃离心，用PB洗2次，用含1%兔血清的生理盐水配成1%红细胞悬液。