动物实验基本技术

第一节 实验动物的抓取和固定

在进行实验时，为了不损伤动物的健康，不影响观察指标，并防止被动物咬伤，首先要限制动物的活动，使动物处于安静状态，工作人员必须掌握合理的抓取固定方法。抓取动物前，必须对各种动物的一般习性有所了解。操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。

一、小鼠

小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。

二、大鼠

大鼠的门齿很长，在抓取方法不当而受到惊吓或激怒时易将操作者手指咬伤,所以,不要突然袭击式地去抓它，取用时应轻轻抓住其尾巴后提起，置于实验台上，用玻璃钟罩扣住或置于大鼠固定盒内，这样即可进行尾静脉取血或注射。如要作腹腔注射或灌胃等操作时，实验者应戴上棉纱手套(有经验者也可不戴)，右手轻轻抓住大鼠的尾巴向后拉，但要避免抓其尖端，以防尾巴尖端皮肤脱落，左手抓紧鼠两耳和头颈部的皮肤，并将大鼠固定在左手中，右手即可进行操作。

三、家兔

家兔比较驯服，不会咬人，但脚爪较尖，应避免家兔在挣扎时抓伤皮肤。常用的抓取方法是先轻轻打开笼门，勿使其受惊，随后手伸入笼内，从头前阻拦它跑动。然后一只手抓住兔的颈部皮毛，将兔提起，用另一只手托其臀，或用手抓住背部皮肤提起来，放在实验台上，即可进行采血、注射等操作。

因家兔耳大，故人们常误认为抓其耳可以提起，或有人用手挟住其腰背部提起均为不正确的操作。

在实验工作中常用兔耳作采血、静脉注射等用，所以家兔的两耳应尽量保持不受损伤。家兔的固定方法有盒式固定和台式固定。盒式固定适用于采血和耳部血管注射，台式固定适用于测量血压、呼吸和进行手术操作等。

四、豚鼠

豚鼠胆小易惊，抓取时必须稳、准、迅速。先用手掌扣住鼠背，抓住其肩胛上方，将手张开，用手指环握颈部，另一只手托住其臀部，即可轻轻提起、固定。

五、蟾蜍

抓取蟾蜍时，可先在蟾蜍体部包一层湿布，用左手将其背部贴紧手掌固定，把后肢拉直，并用左手的中指、无名指及小指夹住，前肢可用拇指及食指压住，右手即可进行实验操作。抓取蟾蜍时不要挤压两侧耳部突起的毒腺，以免蟾蜍将毒液射到使用者眼睛里。需要长时间固定时，可将蟾蜍麻醉或毁脑脊髓后，用大头针钉在蛙板上。

六、狗

用狗做实验时，为防止其咬伤操作人员，一般先将狗嘴绑住。对实验用狗，如毕格狗或驯服的狗，绑嘴时操作人员可从其侧面靠近并轻轻抚摸颈部皮毛，然后迅速用布带绑住狗嘴；对家养的笨狗或未经驯服的狗，先用长柄捕狗狗夹夹住狗的颈部，将狗按倒在地，再绑嘴。如果实验需要麻醉，可先使动物麻醉后再移去狗夹。当狗麻醉后，要松开绑嘴布带，以免影响呼吸。

第二节 实验动物的编号和分组

一、编号

实验动物常需要标记以示区别。编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。

(一)挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。

(二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。

(三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。

(四)化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有

涂染红色：0.5％中性红或品红溶液。

涂染黄色：3-5％苦味酸溶液。

涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。

根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。

(五)剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。

(六)打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。该法可以编至1～ 9999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。

二、分组

(一)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。

每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。

(二)建立对照组：分组时应建立对照组。1.自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，而给正对照组用同样方法进行处理，但并不采用实验所要求的药物或手段，负对照组则不给任何处理。3.具体分组时，应避免人为因素, 随机把所有的动物进行编号，然后令其双数为Ａ组(实验组),单数为B组(对照组)即可或反之。如果要分若干个组时，应该用随机数字表示进行完全随机分组。

第三节 实验动物的麻醉方法

麻醉(anesthesia)的基本任务是消除实验过程中所至的疼痛和不适感觉，保障实验动物的安全，使动物在实验中服从操作，确保实验顺利进行。

一、常用的麻醉药

(一)常用局部麻醉剂：普鲁卡因，此药毒性小，见效快，常用于局部浸润麻醉，用时配成0.5％～1％；利多卡因，此药见效快，组织穿透性好，常用1％～2％溶液作为大动物神经干阻滞麻醉，也可用0.25％～0.5％溶液作局部浸润麻醉。

(二)常用全身麻醉剂：

1. 乙醚 乙醚吸入法是最常用的麻醉方法,各种动物都可应用。其麻醉量和致死量相差大,所以其安全度大。但由于乙醚局部刺激作用大,可刺激上呼吸道粘液分泌增加；通过神经反射还可扰乱呼吸、血压和心脏的活动，并且容易引起窒息，在麻醉过程中要注意。但总起来说乙醚麻醉的优点多，如麻醉深度易于掌握，比较安全，而且麻醉后恢复比较快。其缺点是需要专人负责管理麻醉，在麻醉初期出现强烈的兴奋现象，对呼吸道又有较强的刺激作用，因此，需在麻醉前给予一定量的吗啡和阿托品(基础麻醉)，通常在麻醉前20－30分钟，皮下注射盐酸或硫酸吗啡(每公斤体重5～10mg)及阿托品(每公斤体重0.1mg)。

盐酸吗啡可降低中枢神经系统兴奋性，提高痛阈，还可节省乙醚用量及避免乙醚麻醉过程中的兴奋期。阿托品可对抗乙醚刺激呼吸道分泌粘液的作用，可避免麻醉过程中发生呼吸道堵塞，或手术后发生吸入性肺炎。

进行手术或使用过程中，需要继续给予吸入乙醚，以维持麻醉状态。慢性实验预备手术的过程中，仍用麻醉口罩给药，而在一般急性使用,麻醉后可以先进行气管切开术,通过气管套管连接麻醉瓶继续给药。在继续给药过程中，要时常检查角膜反射和观察瞳孔大小(如发现角膜反射消失，瞳孔突然放大，应立即停止麻醉。万一呼吸停止，必须立即施行人工呼吸。待恢复自动呼吸后再进行操作。

2. 苯巴比妥钠 此药作用持久,应用方便，在普通麻醉用量情况下对于动物呼吸、血压和其它功能无多大影响。通常在实验前半至一小时用药。使用剂量及方法为：狗腹腔注射80～100mg/kg体重，静脉注射70～120mg/kg体重( 一般每公斤体重给70～80mg即可麻醉，但有的动物要100～120mg才能麻醉,具体用量可根据各个动物的敏感性而定)。兔腹腔注射150～200mg/kg体重。

3. 戊巴比妥钠 此药麻醉时间不很长,一次给药的有效时间可延续3-5小时,所以十分适合一般使用要求。给药后对动物循环和呼吸系统无显著抑制作用，药品价格也很便宜。用时配成1～３％生理盐水溶液，必要时可加温溶解， 配好的药液在常温下放置1～2月不失药效。静脉或腹腔注射后很快就进入麻醉期，使用剂量及方法为：狗、猫、兔静脉注射30～35mg/kg体重,腹腔注射40～45mg/kg体重。

4. 硫喷妥钠 为黄色粉末，有硫臭，易吸水。其水溶液不稳定，故必须现用现配,常用浓度为1～5％。此药作静脉注射时，由于药液迅速进入脑组织，故诱导快，动物很快被麻醉。但苏醒也很快，一次给药的麻醉时效仅维持半至一小时。在时间较长的实验过程中，可重复注射，以维持一定的麻醉深度。此药对胃肠道无副作用，但对呼吸有一定抑制作用，由于其抑制交感神经较副交感神经为强,常有喉头痉挛,因此注射时速度必须缓慢。实验剂量和方法：狗静脉注射20～25mg/kg体重；兔静脉注射7～10mg/kg体重。静脉注射速度以15秒钟注射2ml左右进行。小鼠1％溶液腹腔注射0.1～0.3ml/只；大鼠0.6～0.8ml/只。

5. 巴比妥钠 使用剂量及方法：狗静脉注射225mg/kg体重；兔腹腔注射200mg/kg体重；鼠皮下注射200mg/kg体重。

6. 氨基甲酸乙酯 此药是比较温和的麻醉药，安全度大。多数实验动物都可使用,更适合于小动物。一般用作基础麻醉，如使用全部过程都用此麻醉时，动物保温尤为重要。使用时常配成20～25％水溶液，狗、兔静脉、腹腔注射0.75～1g/kg体重。但在作静脉注射时必须溶在生理盐水中，配成5％或10％溶液， 及每公斤体重注射10～20ml。鼠1.5～2g/kg体重，由腹腔注射。

以上麻醉药种类虽较多，但各种动物使用的种类多有所侧重。如做慢性实验的动物常用乙醚吸入麻醉(用吗啡和阿托品作基础麻醉)；急性动物实验对狗、猫和大鼠常用戊巴比妥钠麻醉；对家兔和青蛙、蟾蜍常用氨基甲酸乙酯；对大鼠和小鼠常用硫喷妥钠或氨基甲酸乙酯麻醉。

二、麻醉方法

(一)全身麻醉：麻醉药经呼吸道吸入或静脉、肌肉注射,产生中枢神经系统抑制,呈现神志消失，全身不感疼痛，肌肉松弛和反射抑制等现象，这种方法称全身麻醉。其特点为抑制深浅与药物在血液内的浓度有关,当麻醉药从体内排出或在体内代谢破坏后,动物逐渐清醒，不留后遗症。

1. 吸入麻醉法 麻醉药以蒸气或气体状态经呼吸道吸入而产生麻醉者，称吸入麻醉，常用乙醚作麻醉药。吸入法对多数动物有良好的麻醉效果，其优点是易于调节麻醉的深度和较快的终止麻醉，缺点是中、小型动物较适用，对大型动物如狗的吸入麻醉操作复杂，通常不用。

具体方法是：使用乙醚麻醉兔及大小鼠时，可将动物放入玻璃麻醉箱内，把装有浸润乙醚棉球的小烧杯放入麻醉箱，然后观察动物。开始动物自主活动，不久动物出现异常兴奋，不停地挣扎，随后排出大小便。渐渐地动物由兴奋转为抑制，倒下不动，呼吸变慢。如动物四肢紧张度明显减低，角膜反射迟钝，皮肤痛觉消失，则表示动物已进入麻醉，可行手术和操作。在实验过程中应随时观察动物的变化，必要时把乙醚烧杯放在动物鼻部，以维持麻醉的时间与深度。
2. 注射麻醉法 常用的麻醉药有戊巴比妥钠、硫喷妥钠、氨基甲酸乙酯等。

大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法进行全身麻醉。狗、兔等动物既可腹腔注射给药,也可静脉注射给药。在麻醉兴奋期出现时，动物挣扎不安，为防止注射针滑脱，常用吸入麻醉法进行诱导，待动物安静后再行腹腔或静脉穿刺给药麻醉。

在注射麻醉药物时，先用麻醉药总量的三分之二，密切观察动物生命体征的变化，如已达到所需麻醉的程度，余下的麻醉药则不用，避免麻醉过深抑制延脑呼吸中枢导致动物死亡。

(二)动物局部麻醉方法：用局部麻醉药阻滞周围神经末梢或神经干、神经节、神经丛的冲动传导，产生局部性的麻醉区，称为局部麻醉。其特点是动物保持清醒，对重要器官功能干扰轻微，麻醉并发症少，是一种比较安全的麻醉方法。适用于大中型动物各种短时间内的实验。

局部麻醉操作方法很多，可分为表面麻醉、局部浸润麻醉、区域阻滞麻醉以及神经干(丛)阻滞麻醉。

1. 表面麻醉 利用局部麻醉药的组织穿透作用，透过粘膜,阻滞表面的神经末梢，称表面麻醉。在口腔及鼻腔粘膜、眼结膜、尿道等部位手术时,常把麻醉药涂敷、滴入、喷于表面上，或尿道灌注给药，使之麻醉。

2. 区域阻滞麻醉：在手术区四周和底部注射麻醉药阻断疼痛的向心传导,称区域阻断麻醉。常用药为普鲁卡因。

3. 神经干(丛)阻滞麻醉：在神经干(丛)的周围注射麻醉药，阻滞其传导,使其所支配的区域无疼痛，称神经干(丛)阻滞麻醉。常用药为利多卡因。

4. 局部浸润麻醉：沿手术切口逐层注射麻醉药，靠药液的张力弥散，浸入组织,麻醉感觉神经末梢，称局部浸润麻醉。常用药为普鲁卡因。在施行局部浸润麻醉时，先固定好动物，用0.5～1％盐酸普鲁卡因皮内注射，使局部皮肤表面呈现一桔皮样隆起，称皮丘，然后从皮丘进针，向皮下分层注射，在扩大浸润范围时，针尖应从已浸润过的部位刺入，直至要求麻醉区域的皮肤都浸润为止。每次注射时，必须先抽注射器，以免将麻醉药注入血管内引起中毒反应。

三、使用全身麻醉剂的注意事项

给动物施行麻醉术时,一定要注意方法的可靠性,根据不同的动物选择合适的方法，特别是较贵重的大型动物。

1. 麻醉剂的用量，除参照一般标准外，还应考虑个体对药物的耐受性不同,而且体重与所需剂量的关系也并不是绝对成正比的。一般说，衰弱和过胖的动物，其单位体重所需剂量较小，在使用麻醉剂过程中，随时检查动物的反应情况,尤其是采用静脉注射,绝不可将按体重计算出的用量匆忙进行注射。

2. 动物在麻醉期体温容易下降，要采取保温措施。

3. 静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张、角膜反射和对皮肤夹捏的反应,当这些活动明显减弱或消失时，应立即停止注射。配制的药液浓度要适中不可过高，以免麻醉过急；但也不能过低，以减少注入溶液的体积。

4. 作慢性实验时，在寒冷冬季，麻醉剂在注射前应加热至动物体温水平。

四、实验动物用药量的确定及计算方法

(一)动物给药量的确定

观察一种药物对实验动物的作用时，一个重要的问题就是给动物用多大的剂量较合适。剂量太小，作用不明显，剂量太大，又可能引起动物中毒致死。可以按下述方法确定剂量：

1. 先用少量小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量,然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一作为应用剂量，一般可取1/10～1/5。

2. 植物药粗制剂的剂量多按生药折算。

3. 化学药品可参考化学结构相似的已知药物， 特别是化学结构和作用都相似的剂量。

4. 确定剂量后，如第一次用药的作用不明显，动物也没有中毒的表现,可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。

5. 用大动物进行实验时，防止动物中毒死亡,开始的剂量可采用鼠类的1/15～1/2,以后可根据动物的反应调整剂量。

6. 确定动物给药剂量时，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。 一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼龄动物，剂量应减小。如以狗为例：6 个月以上的狗给药剂量为1份时，3～6个月的给1/2份， 45～89日的给1/4份，20～44日的给1/8 份，10～19日的给1/16份。

7. 确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同。 以口服量为100时，皮下注射量为30～50，肌肉注射量为20～30，静脉注射量为25。

(二)人与动物的用药量换算方法

人与动物对同一药物耐受性不同，一般动物的耐受性要比人大，单位体重的用药量动物比人要高。必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算：
人用药量： 1
小鼠、大鼠： 50～100
兔、豚鼠： 15～20
狗、猫： 5～10
以上系按单位体重口服用药量换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。

第四节 实验动物的除毛、给药方法

一、实验动物的除毛

在动物实验中，被毛有时会影响实验操作与观察，因此必须除去。除去被毛的方法有剪毛、拔毛、剃毛和脱毛等。

(一)剪毛法：剪毛法是将动物固定后，先用蘸有水的纱布把被毛浸湿，再用剪毛剪刀紧贴皮肤剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮肤。剪下的毛应集中放在一容器内，防止到处飞扬。给狗、羊等动物采血或新生乳牛放血制备血清常用此法。

(二)拔毛法：拔毛法是用拇指和食指拔去被毛的方法。在兔耳缘静脉注射或尾静脉注射时常用此法。

(三)剃毛法：剃毛法是用剃毛刀剃去动物被毛的方法。如动物被毛较长，先要用剪刀将其剪短，再用刷子蘸温肥皂水将剃毛部位浸透，然后再用剃毛刀除毛。本法适用于暴露外科手术区。

(四)脱毛法：脱毛法是用化学药品脱去动物被毛的方法。首先将被毛剪短，然后用棉球蘸取脱毛剂，在所需部位涂一薄层，2～3分钟后用温水洗去脱落的被毛，用纱布擦干，再涂一层油脂即可。

适用于狗等大动物的脱毛剂配方为：硫化钠10g，生石灰15g，溶于100ml水中。

适用于兔、鼠等动物的脱毛剂的配方为：1. 硫化钠3g,肥皂粉1g,淀粉7g,加适量水调成糊状；2. 硫化钠8g,淀粉7g，糖4g，甘油5g，硼砂1g,加水75ml；3. 硫化钠8g溶于100ml水中。

二、实验动物的给药

在动物实验中，为了观察药物对机体功能、代谢及形态引起的变化，常需要将药物注入动物体内。给药的途径和方法多种多样，可根据实验目的、实验动物种类和药物剂型、剂量等情况确定。

(一)注射给药法

1. 皮下注射 注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入,固定后即可进行注射。一般小鼠在背部或前肢腋下，大鼠在背部或侧下腹部；豚鼠在后大腿内侧、背部等脂肪少的部位；兔在背部或耳根部注射；蛙可在脊背部淋巴囊注射；狗多在大腿外侧注射，拔针时，轻按针孔片刻，防药液逸出。

2. 皮内注射 此法用于观察皮肤血管的通透性变化或观察皮内反应。 如将一定量的放射性同位素溶液、颜料或致炎物质、药物等注入皮内，观察其消失速度和局部血液循环变化，作为皮肤血管通透性观察指标之一。方法是：将动物注射部位的毛剪去，消毒后，用皮试针头紧贴皮肤皮层刺入皮内，然后使针头向上挑起并再稍刺入，即可注射药液。注射后可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。

3. 肌肉注射 当给动物注射不溶于水而混悬于油或其他溶剂中的药物时,常采用肌肉注射。肌肉注射一般选用肌肉发达、无大血管经过的部位，多选臀部。

注射时针头要垂直快速刺入肌肉，如无回血现象即可注射。给大、小鼠作肌肉注射时，选大腿外侧肌肉进行注射。

4. 腹腔注射 先将动物固定,腹部用酒精棉球擦试消毒，然后在左或右侧腹部将针头刺入皮下，沿皮下向前推进约0.5厘米，再使针头与皮肤呈45 度角方向穿过腹肌刺入腹腔，此时有落空感，回抽无肠液、尿液后，缓缓推入药液。此法大小鼠用的较多。

5. 静脉注射 是将药液直接注射于静脉管内，使其随着血液分布全身,迅速奏效。但排泄较快，作用时间较短。

小鼠、大鼠的静脉注射：常采用尾静脉注射。鼠尾静脉共有3根， 左右两侧和背侧各1根，两侧尾静脉比较容易固定，故常被采用。操作时，先将动物固定在暴露尾部的固定器内(可用烧杯、铁丝罩或粗试管等物代替),用75％酒精棉球反复擦试使血管扩张, 并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈,注射时针头尽量采取与尾部平行的角度进针。开始注射时宜少量缓注，如无阻力,表示针头已进入静脉,这时用左手指将针和尾一起固定起来，解除对尾根部的压迫后，便可进行注射。如有白色皮丘出现，说明未穿刺入血管，应重新向尾部方向移动针头再次穿刺。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，尽量从尾的末端开始。 一次的注射量为每10g体重0.1-0.2ml。

豚鼠的静脉注射：一般采用前肢皮下头静脉。鼠的静脉管壁较脆，注射时应特别注意。

兔的静脉注射：一般采用外耳缘静脉，因其表浅易固定。注射部位除毛，用75％的酒精消毒，手指轻弹兔耳，使静脉充盈，左手食指和中指夹住静脉的近心端，拇指绷紧静脉的远心端，无名指及小指垫在下面，右手持注射器，尽量从静脉的远端刺入血管，移动拇指于针头上以固定，放开食、中指，将药液注入，然后拔出针头，用手压迫针眼片刻以止血。

狗的静脉注射：狗的静脉注射多采用前肢外侧静脉或后肢外侧的小隐静脉。注射部位除毛后，在静脉血管的近心端用橡皮带扎紧，使血管充盈，从静脉的远心端将注射针头平行血管刺入，回抽注射器针栓，如有回血，即可放开像皮带，将药液缓缓注入。

6. 淋巴囊注射 蛙类常采用此法,其皮下有数个淋巴囊，注入药物甚易吸收。腹部淋巴囊和头部淋巴囊常作为蛙类给药途径。一般多选用腹部淋巴囊给药。注射时将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，即进入淋巴囊，然后注入药液。

(二)经口给药法

1. 口服法：把药物放入饲料或溶于饮水中让动物自动摄取。此法优点在于简单方便，缺点是不能保证剂量准确。一般适用于对动物疾病的防治或某些药物的毒性实验，制造某些与食物有关的人类疾病动物模型。

2. 灌胃法：在急性实验中,多采用灌胃法。此法剂量准确。灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动物胃内。灌胃器由注射器和特殊的灌胃针构成。小鼠的灌胃针长约4～5cm，直径为1mm，大鼠的灌胃针长约6～8cm，直径约1.2mm。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成20°左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向。

鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为3～4cm，大鼠或豚鼠为4～6cm。常用灌胃量小鼠为0.2～1ml,大鼠1～4ml,豚鼠1～5ml。

狗、兔的灌胃法：先将动物固定，再将开口器的小孔插入动物口中，再慢慢沿上鄂壁插入食道，将灌胃管的外端浸入水中，如有气泡逸出，则说明灌胃管误入气管，需拔出重插。插好后，将注射器连于灌胃管将药液推入。灌胃结束后，先拔出灌胃管，再拿出开口器。一次灌胃能耐受的最大容积兔为80～100ml，狗为 200 ～250ml。

(三)其它途径给药方法

1. 呼吸道给药：呈粉尘、气体及蒸气或雾等状态的药物或毒气,均需要通过动物呼吸道给药。如实验时给动物乙醚作吸入麻醉、用锯末烟雾制作慢性气管炎动物模型等，特别在毒理学实验中应用更为广泛。

2. 皮肤给药：为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、 致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定的药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。

3. 脊髓腔内给药：此法主要用于锥管麻醉或抽取脑脊液。

4. 脑内给药：此法常用于微生物学动物实验,将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。

5. 直肠内给药：此种方法常用于动物麻醉。兔直肠内给药时,常采用灌肠的胶皮管或用14号导尿管代替。

6. 关节腔内给药：此法常用于关节炎的动物模型复制。

第五节 实验动物的采血法

实验研究中，经常要采集实验动物的血液进行常规质量检测、细胞学实验或进行生物化学分析，故必须掌握正确的采集血液的技术。采血方法的选择，主要决定于实验的目的和所需血量以及动物种类。

一、大鼠、小鼠的采血方法

(一)剪尾采血：需血量很少时常用本法，如作红、白细胞计数、血红蛋白测定、制作血涂片等可与此法。动物麻醉后，将尾尖剪去约5mm，从尾部向尾尖部按摩，血即从断端流出。也可用刀割破尾动脉或尾静脉，让血液自行流出。如不麻醉，采血量较小。采血结束后，消毒、止血。用此法每只鼠可采血10余次。小鼠可每次采血约0.1ml，大鼠约0.4ml。

(二)眼眶后静脉丛采血：穿刺采用一根特制的长7～10cm硬的玻璃取血管,其一端内径为1 ～1.5mm，另一端逐渐扩大，细端长约1cm即可，将取血管浸入1％肝素溶液，干燥后使用。采血时，左手拇指及食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定，并轻轻压迫颈部两侧，阻碍静脉回流，使眼球充分外突，提示眼眶后静脉丛冲血。右手持取血管，将其尖端插入内眼角与眼球之间，轻轻向眼底方向刺入，当感到有阻力时即停止刺入，旋转取血管以切开静脉丛，血液即流入取血管中。采血结束后，拔出取血管，放松左手，出血即停止。用本法在短期内可重复采血。小鼠一次可采血0.2～0.3ml，大鼠一次可采血0.5～1.0ml。

(三)颈(股)静脉或颈(股)动脉采血：将鼠麻醉，剪去一侧颈部外侧被毛，作颈静脉或颈动脉分离手术,用注射器即可抽出所需血量。大鼠多采用股静脉或股动脉,方法是：大鼠经麻醉后，剪开腹股沟处皮肤，即可看到股静脉，把此静脉剪断或用注射器采血即可，股动脉较深需剥离出，再采血。

(四)摘眼球采血：此法常用于鼠类大量采血。采血时,用左手固定动物,压迫眼球，尽量使眼球突出，右手用镊子或止血钳迅速摘除眼球，眼眶内很快流出血液。
(五)断头采血：用剪子迅速剪掉动物头部，立即将动物颈朝下，提起动物，血液可流入已准备好的容器中。

二、豚鼠采血方法

(一)耳缘切口采血：先将豚鼠耳消毒,用刀片沿血管方向割破耳缘,切口约长0.5cm,在切口边缘涂上20％的柠檬酸钠溶液，防治血凝，则血可自切口处流出。此法采血每次可采0.5ml。

(二)背中足静脉采血：固定豚鼠，将其右或左后肢膝关节伸直，脚背消毒，找出足静脉，左手拇指和食指拉住豚鼠的趾端，右手将注射针刺入静脉，拔针后立即出血。

(三)心脏采血：用手指触摸，选择心跳最明显的部位，把注射针刺入心脏，血液即流入针管。心脏采血时所用的针头应细长些，以免发生采血后穿刺孔出血。
三、兔的采血方法

(一)耳缘静脉采血：将兔固定,拔去耳缘静脉局部的被毛，消毒，用手指轻弹兔耳,使静脉扩张，用针头刺耳缘静脉末端,或用刀片沿血管方向割破一小切口,血液即流出。本法为兔最常用的采血方法，可多次重复使用。

(二)耳中央动脉采血：在兔耳中央有一条较粗的、颜色较鲜红的中央动脉。用左手固定兔耳，右手持注射器，在中央动脉的末端，沿着与动脉平行的向心方向刺入动脉，即可见血液进入针管。由于兔耳中央动脉容易痉挛，故抽血前必须让兔耳充分充血，采血时动作要迅速。采血所用针头不要太细，一般用6号针头，针刺部位从中央动脉末端开始，不要在近耳根部采血。

(三)颈静脉采血：方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血。

(四)心脏采血：使家兔仰卧，穿刺部位在第三肋间胸骨左缘3mm处， 针头刺入心脏后，持针手可感觉到兔心脏有节律的跳动。此时如还抽不到血，可以前后进退调节针头的位置，注意切不可使针头在胸腔内左右摆动，以防弄伤兔的心、肺。

四、狗的采血方法

(一)后肢外侧小隐静脉采血：后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下三分之一的外侧浅表皮下，由前侧方向后行走。采血时，将动物固定，局部剪毛、消毒，采血者左手紧握剪毛区上部或扎紧止血带，使下部静脉充血，右手用连有6号或7号针头的注射器刺入静脉，左手放松，已适当速度抽血即可。

(二)前肢背侧皮下头静脉采血：前肢背侧皮下头静脉位于前脚爪的上方背侧的正前位。采血方法同上。

(三)颈静脉采血：前两种方法需技术熟练,且不适于连续采血。大量或连续采血时,可采用颈静脉采血，方法同小鼠、大鼠的颈静脉采血方法。

(四)股动脉采血：本法为采取动脉血最常用的方法。操作简便，稍加训练的狗，在清醒状态下将狗卧位固定于狗解剖台上。伸展后肢向外伸直，暴露腹股沟三角动脉搏动的部位，剪毛、消毒，左手中指、食指探模股动脉跳动部位，并固定好血管，右手取连有5号半针头的注射器，针头由动脉跳动处直接刺入血管，若刺入动脉一般可见鲜红血液流入注射器，有时还需微微转动一下针头或上下移动一下针头，方见鲜红血液流入。有时可能刺入静脉，必须重抽。抽血毕，迅速拔出针头，用干药棉压迫止血2-3分钟。

第六节 实验动物各种体液、骨髓的采集方法

一、消化液的采集

(一) 唾液

1. 直接抽取法 在急性实验中， 可用吸管直接插入动物口腔或唾液腺导管抽吸唾液，此法非常简单，但从口腔抽吸唾液会有杂质混入。

2. 制造腮腺瘘法 在慢性实验中,收集狗的唾液，要用外科手术方法将腮腺导管开口移向体外，即以腮腺导管为中心，切成一直径约2～3cm的圆形粘膜片，将此粘膜片，与周围组织分开，穿过皮肤切口引到颊外,将带有导管开口的粘膜片与周围的皮肤缝合,腮腺分泌的唾液就流出颊外。这种方法可以收集到较纯净的唾液。

(二)胃液

1. 直接收集胃液法 急性实验时，先将动物麻醉，将插胃管经口插入胃内,在灌胃管的出口连一注射器，用此注射器可收集到胃液,此法适用于狗等大型动物。如是大鼠,需手术剖腹，从幽门端向胃内插入一塑料管，再由口腔经食道将一塑料管插入前胃，用pH7.5、35℃左右的生理盐水，以12ml/h的流速灌胃，收集流出液，进行分析。

2. 制备胃瘘法 在慢性实验中,收集胃液多用胃瘘法,如全胃瘘法、巴氏小胃瘘法、海氏小胃瘘法等。制备小胃是将动物的胃分离出一小部分，缝合起来形成小胃，主胃与小胃互不相通，主胃进行正常消化，从小胃可收集到纯净的胃液。应用该法，可以待动物恢复健康后，在动物清醒状态下反复采集胃液。

(三)胰液和胆汁

在动物实验中，主要是通过对胰总管和胆总管的插管而获得胰液或胆汁。狗的胰总管开口于十二指肠降部，在紧靠肠壁处切开胰管，结扎固定并与导管相连，即可见无色的胰液流入导管。大鼠的胰管与胆管汇集于一个总管，在其入肠处插管固定，并在近肝门处结扎和另行插管，可分别收集到胰液和胆汁。

有时也可通过制备胰瘘和胆囊瘘来获得胰液和胆汁。

四、脑脊液的采集

(一)狗、兔脑脊液的采集通常采取脊髓穿刺法：穿刺部位在两髂连线中点稍下方第七腰椎间隙。动物轻度麻醉后，侧卧位固定，使头部及尾部向腰部尽量弯曲，剪去第七腰椎周围的被毛。消毒后操作者在动物背部用左手姆、食指固定穿刺部位的皮肤，右手持腰穿刺针垂直刺入，当有落空感及动物的后肢跳动时，表明针已达椎管内( 蛛网膜下腔)，抽去针芯,即见脑脊液流出。如果无脑脊液流出，可能是没有刺破蛛网膜。轻轻调节进针方向及角度，如果脑脊液流的太快，插入针芯稍加阻塞，以免导致颅内压突然下降而形成脑疝。

(二)大鼠脑脊液的采集可采用枕大孔直接穿刺法

在大鼠麻醉后，头部固定于定向仪上。头颈部剪毛、消毒，用手术刀沿纵轴切一纵行切口(约2cm）用剪刀钝性分离颈部背侧肌肉。为避免出血，最深层附着在骨上的肌肉用手术刀背刮开，暴露出枕骨大孔。由枕骨大孔进针直接抽取脑脊液。抽取完毕逢好外层肌肉、皮肤。刀口处可撒些磺胺药粉，防止感染。采完脑脊液后，应注入等量的消毒生理盐水，以保持原来脑脊髓腔的压力。

五、尿液的采集

常用的采集方法较多，一般在实验前需给动物灌服一定量的水。

(一)代谢笼法：此法较常用，适用于大、小鼠。将动物放在特制的笼内。动物排便时，可以通过笼子底部的大小便分离漏斗将尿液与粪便分开，达到采集尿液的目的。

由于大、小鼠尿量较少，操作中的损失和蒸发，各鼠膀胱排空不一致等原因，都可造成较大的误差，因此一般需收集5小时以上的尿液，最后取平均值。

(二)导尿法：常用于雄性兔、狗。动物轻度麻醉后，固定于手术台上。由尿道插入导尿管(顶端应用液体石蜡涂抹)，可以采到没有受到污染的尿液。

(三)压迫膀胱法：在实验研究中，有时为了某种实验目的，要求间隔一定的时间，收集一次尿液，以观察药物的排泄情况。动物轻度麻醉后，实验人员用手在动物下腹部加压，手要轻柔而有力。当加的压力足以使动物膀胱括约肌松驰时，尿液会自动由尿道排出。此法适用于兔、狗等较大动物。

(四)输尿管插管法：动物麻醉后，固定于手术台上。剪毛、消毒，于耻骨联合上缘之上在正中线做皮肤切口(长约3～4cm),沿腹中线切开腹壁及腹膜,找到膀胱翻出腹外。辨认清楚输尿管进入膀胱背侧的部位(膀胱三角)后，细心地分离出两侧输尿管，分别在靠近膀胱处穿线结扎。在离此结扎点约2cm 处的输尿管近肾段下方穿一根丝线。用眼科剪在管壁上剪一斜向肾侧的小切口，分别插入充满生理盐水的细塑料管( 插入端剪成斜面)，用留置的线结扎固定。可见到尿滴从插管中流出( 头几滴是生理盐水)，塑料管的另一端与带刻度的容器相连或接在记滴器上， 以便记录尿量。 在适用过程中应经常活动一下输尿管插管，以防阻塞。在切口和膀胱处应盖上温湿的生理盐水纱布。

(五)膀胱插管法：腹部手术同输尿管插管。将膀胱翻出腹外后，用丝线结扎膀胱颈部，阻断它同尿道的通路。然后在膀胱顶部避开血管剪一小口，插入膀胱漏斗，用丝线做以荷包缝合固定。漏斗最好正对着输尿管的入口处。注意不要紧贴膀胱后壁而堵塞输尿管。下端接橡皮管插入带刻度的容器内以收集尿液。

(六)穿刺膀胱法：动物麻醉后固定于手术台上，在耻骨联合之上腹正中线剪毛，消毒后进行穿刺，入皮后针头应稍改变一下角度，以避免穿刺后漏尿。

(七)剖腹采尿法：同穿刺法做术前准备，皮肤准备范围应大一点。剖腹暴露膀胱，操作者的左手用无齿小平镊夹住一小部分膀胱，右手持针在小镊夹住的膀胱部位直视穿刺抽取尿液。可避免针头贴在膀胱壁上而抽不出尿液。

(八)反射排尿法：适用于小鼠，因小鼠被人抓住尾巴提起时排便反射比较明显。故需采取少量尿液时，可提起小鼠，将排出的尿液接到带刻度的容器内。

六、精液的采集

(一)人工阴道采集精液(semen)：体型较大的动物，如狗、猪、羊等,可用一专门的人工阴道套在发情的雄性动物阴茎上，采集精液。也可将人工阴道置入雌性动物的阴道内，待动物交配完毕后，取出人工阴道采集精液。还可将人工阴道固定在雌性动物外生殖器附近，雄性动物阴茎开始插入时,立即将其阴茎移入人工阴道内，待其射精完毕后,采集人工阴道内的精液。

(二)阴道栓采集精液：大小鼠雌雄交配后，24小时内可在雌性动物阴道口出现白色透明的阴道栓，这是雄鼠的精液和雌鼠阴道分泌液在阴道内凝固而成的，取阴道栓涂片染色可观察到凝固的精液。

(三)其它采集精液法：将发情的雌性动物放在雄性动物一起，当雄性动物被刺激发情后，立即将雄性动物分开，再用人工法刺激其射精。也可按摩雄性动物的生殖器或用电刺激其发情中枢或性敏感区，使其射精。

七、阴道内液体的采集

(一)棉拭子法：用消毒棉拭子旋转插入动物阴道内，然后在阴道内轻轻转动几下后取出，即可进行涂片镜检。有的适用如大、小鼠等，阴道液较少，取其阴道液时，可用先浸湿后又挤尽无菌生理盐水的棉拭子取阴道液,这种棉拭子比干棉拭子容易插入阴道。对体型较大的实验动物，也可先按摩或刺激其阴部，而后再采集其阴道液。

(二)滴管法：用消毒的钝头滴管吸取少量的无菌生理盐水插入动物阴道内，然后挤出生理盐水后又吸入，反复几次，吸取阴道冲洗液滴于玻片上制片、染色镜检。

(三)刮取法：用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入阴道内，在阴道壁轻轻刮取一点阴道内含物，进行涂片镜检。

八、胸水的采集

收集胸水常采用穿刺法。如果实验不要求动物继续存活，也可用处死动物剖胸取胸水。穿刺部位在动物脊侧腋后线胸壁第11～12肋间隙穿刺较安全。此部位是肺最下界之外侧，既可避免损伤肺组织造成气胸，又易采集在隔肋窦的胸水。此外，也可在腹侧胸壁近胸骨左侧缘第4～5肋间隙穿刺。

动物穿刺部位剪毛、消毒，操作者左手拇、食指绷紧肋间穿刺部位的皮肤，用带夹的橡皮管套上12～14号针头，沿肋骨前缘小心地垂直刺入。当有阻力消失或落空感时，表示已穿入胸腔。再接上针管，除去夹子，缓缓抽取胸水。如果有条件在穿刺针头与注射器之间连一个三通管，但应注意正确运用三通管。穿刺结束迅速拔出针头，轻揉穿刺部位，促进针孔闭合并注意消毒。

操作中严防空气进入胸腔，始终保持胸腔负压。穿刺应用手控制针头的深度，以防穿刺过深刺伤肺脏。

九、腹水的采集

抽取狗等大动物腹水，让狗按自然站立位固定，穿刺部位在耻骨前缘与脐之间，腹中线两侧。剪毛消毒，局部浸润麻醉。操作者左手姆、食指紧绷穿刺部位的皮肤，右手控制穿刺深度做垂直穿刺。注意不可刺的太深，以免刺伤内脏。穿刺针进入腹腔后，腹水多时可见因腹压高而自动流出。腹水太少可轻轻回抽，并同时稍稍转动一下针头，一旦有腹水流出，立即固定好针头及注射器的位置连续抽取。

抽取大鼠、小鼠的腹水方法简单，用左手拇指及食指捏住动物颈部皮肤，无名指、小手指及手掌夹住其尾巴固定好动物，使其腹部略朝上，在腹股沟和腹中线之间，消毒皮肤,用8号针头刺入腹腔,如腹压高腹水自然流出，如腹水太少，可借助注射器抽取。

抽腹水时注意不可速度太快，腹水多时不要一次大量抽出，以免因腹压突然下降导致动物出现循环功能障碍等问题。

十、骨髓的采集

1. 大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物,剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的Hank平衡盐溶液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液。如果是取少量的骨髓作检查，可将胸骨或股骨剪断，将其断面的骨髓挤在有稀释液的玻片上，混匀后涂片凉干即可染色检查。

2. 大动物骨髓的采集：狗等大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法。 先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，穿入固定后，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。狗骨髓的采集，一般采用髂骨穿刺。

狗等大动物常用的骨髓穿刺点：胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处。肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点。胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。

第七节 实验动物的处死

当实验中途停止或结束时，实验者应站在实验动物的立场上以人道的原则去处置动物，原则上不给实验动物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安乐死。安乐死是指实验动物在没有痛苦感觉的情况下死去。实验动物安乐死方法的选择取决于动物的种类与研究的课题。

一、蛙 类

常用金属探针插入枕骨大孔,破坏脑脊髓的方法处死。将蛙用湿布包住，露出头部,左手执蛙，并用食指按压其头部前端，拇指按压背部，使头前俯；右手持探针由凹陷处垂直刺入，刺破皮肤即入枕骨大孔。这时将探针尖端转向头方，向前深入颅腔，然后向各方搅动，以捣毁脑组织。再把探针由枕骨大孔刺入并转向尾方，刺入椎管，以破坏脊髓。脑和脊髓是否完全破坏,可检查动物四肢肌肉的紧张性是否完全消失。拔出探针后,用一小干棉球将针孔堵住,以防止出血。操作过程中要防止毒腺分泌物射入实验者眼内。如被射入时，则需立即用生理盐水冲洗眼睛。

二、大鼠和小鼠

1. 颈椎脱臼法：右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断，鼠便立即死亡。

2. 断头法：用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉，鼠立即死亡。

3. 击打法：右手抓住鼠尾,提起，用力摔击其头部，鼠痉挛后立即死去。或用木锤用力击打鼠头部也可致死。

4. 急性大出血法：可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。

5. 药物致死法：吸入一定量的一氧化碳、乙醚、氯仿等均可使动物致死。

三、狗、兔、豚鼠

1. 空气栓塞法：向动物静脉内注入一定量的空气,使之发生栓塞而死。当空气注入静脉后，可在右心随着心脏的跳动使空气与血液成泡沫状，随血液循环到全身。如进到肺动脉，可阻塞其分支，进入心脏冠状动脉，造成冠状动脉阻塞，发生严重的血液循环障碍，动物很快致死。一般兔、猫等静脉内注入20～40ml空气即可致死。每条狗由前肢或后肢皮下静脉注入80～150ml空气，可很快致死。

2. 急性失血法：先使动物轻度麻醉，如狗可按每公斤体重静脉注射硫喷妥钠20～30mg，动物即很快入睡。暴露股三角区，用锋利的杀狗刀在股三角区作一个约10厘米的横切口，把股动、静脉全切断，立即喷出血液。用一块湿纱布不断擦去股动脉切口周围处的血液和血凝块,同时不断的用自来水冲洗流血,使股动脉切口保持畅通，动物在3～5分钟内即可致死。采用此种方法，动物十分安静，对脏器无损伤，对活杀采集病理切片标本是一种较好的方法。

如果处死狗的同时要采集其血液时，则在用硫喷妥钠轻度麻醉后，将狗固定在狗手术台上。分离颈动脉，插一根较粗的塑料管，放低狗头，打开动脉夹，使动脉血流入装有抗凝血的容器内，并不断摇晃，以防血液凝固。

第八节 转基因动物

1980年底Gordon等人首次将克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠输卵管,培育出第1个转基因动物。这种将外源性基因用实验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得具有插入基因特性，并能正常繁衍的动物称为转基因动物 ( transgenicanimals)。转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。

转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。

一、转移基因

(一)转移基因的原理：转基因技术的理论基础在于各种生物的遗传密码都是统一的。都是以3个碱基决定一个氨基酸这样的密码形式贮存在DNA链上，各物种间形状的不同仅仅是由于DNA上的四种核苷酸排列次序的不同，同时各种生物从DNA到蛋白质合成都服从“中心法则”,当一个物种的细胞内加入另一物种或人工合成的DNA(即基因)后就可能产生新的性状。

(二)基因的获得：取自现有的生物体如病毒、细菌、体细胞或肿瘤细胞的DNA,用限制内切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把这些小段利用连接酶分别放入载体中,并建成载体克隆。载体通常是一种独立的，能自我复制的遗传物质，如质粒、某些噬菌体和病毒均可作为载体。基因的片断可随载体复制，有时亦可表达，用DNA 或抗体探针做分子杂交试验或ELISA试验筛选出带有理想基因的克隆,再把理想基因载体放入大肠杆菌等宿主细胞中扩大、增殖,或采用PCR的方法扩增。再对扩增的DNA片断进行适当修饰,例如将一个单一的基因与经选择的启动子重组合，然后进行转移，或将特定的控制序列连接到目的基因的结构序列上，从而创造1个新的重组基因,然后再进行转移。

理想基因也可用人工合成的办法获得，要合成一特定的基因，就是要合成具有一定排列顺序的DNA，DNA上四种碱基的配对是非常严格的,腺嘌呤(A)必定和胸腺嘧啶(T) 配对，鸟嘌呤(G)必定和胞嘧啶(C)配对，由于蛋白质合成不是直接以DNA作为模板,而是以DNA的副本mRNA作为模板，在RNA中，用尿嘧啶(U)代替了胸腺嘧啶(T)。

二、基因转移的受体细胞

研究转基因动物的制备，首先要考虑用何种转基因受体细胞。选择合适的受体细胞和可行的基因导入途径，是该技术成功的前提。基因转移的受体细胞必须是全能细胞，全能细胞随着细胞分化、胚胎发育，可以把其中的基因组贮存的全部遗传信息扩大到生物体所有的细胞中。除此以外至少是多能细胞。满足转基因动物需要的受体细胞有以下几种。

(一)原生殖细胞：禽类的原生殖细胞容易分离、培养和冷冻，所以，这种受体细胞在禽类动物较易实现。

(二)配子：配子能把自身携带的基因组全部信息和外源插入基因序列，完整地贡献给合子。由于精子可用作有效的转移载体，所以，可以精子作为目的基因的受体。较多的是用重组病毒直接感染精子，精子即可把外源基因传到合子。

(三)受精卵或胚胎内细胞团：精卵结合形成的单细胞受精卵，是最常用的外源基因转移的受体；受精后的早期胚胎及囊胚期稍后的胚胎含有的内细胞团，该细胞团内含有未分化的胚胎干细胞，也可认为是全能的，或至少是多能性的，所以，用该时期的内细胞团或囊胚期的细胞作为外源基因的受体细胞，也可望达到基因转移的目的。但这种情况下制备的转基因动物多为嵌合体。

三、实验动物的准备

本文主要叙述制备转基因鼠的实验程序。

(一)不育雄性公鼠:结扎公鼠与母鼠交配以后产生假孕母鼠。受结扎的公鼠需8周以上，对种系无特殊要求。在正式实验前，结扎公鼠需与性成熟的雌性小鼠交配，反复交配两次或三次，经检查雌体有阴道栓，但均不怀孕产仔，则证明结扎成功。结扎公鼠使母鼠产生阴道栓的能力可维持2年。值得注意的是，如结扎公鼠与母鼠交配4～6 次均不能产生阴道栓，则该公鼠必须更换。

(二)假孕雌性母鼠:作为获得外源基因即转基因胚胎的养母，要求6周龄至5 个月较合适，对种系无特殊要求。其生殖系统的生理状态应与移进胚胎的发育阶段同步化，从而为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。将选好的成年健康雌性个体与不育雄性个体进行交配，时间应与供体(取受精卵的雌体)同时进行。一般为下午4点钟合笼,次日晨选有阴道栓的待用。

(三)取受精卵的雌性母鼠：如果无特殊遗传背景的要求，一般用杂交F1受精卵较为理想。因杂交F1代胚胎的发育能力和对外环境的耐受能力都较强，有益于提高移植胚胎的出生率。在对遗传背景有特殊要求的情况下，供卵母鼠需选择种系，例如把一种鼠的等位基因转移到另一种不同等位基因的种系，这种卵供体母鼠必须有特定的遗传背景，因此需用纯系鼠。在实际操作中，一般用4～6周母鼠作为超排卵供体，3～4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理过程中易破裂，而6周以后母鼠产卵逐渐减少。

(四)与卵供体母鼠交配的正常公鼠：公鼠性成熟约在6～8周，不同种系有些区别。每个作超排卵的母鼠与一只公鼠交配，次日上午检查是否有阴道栓并作记录。如两次以上都不能使母鼠有阴道栓，或总的阴道栓产生率低于60～80％，则需更换公鼠。

四、基因导入的方法

(一)显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核),注入特定的外源基因,即为基因显微注射法。下面把利用显微注射法制备转基因鼠的方法和步骤简述如下。

1. 超数排卵(超排)与取卵

(1)超数排卵：在雌性动物发情周期的某一阶段,用促性腺激素促使卵巢里大量卵泡成熟并排出，称超数排卵。影响母鼠超排因素有母鼠的性成熟程度、营养、体重及母鼠种系。超排的最佳时间随种系不同而异,一般在3～5周，超过6周超排卵数明显减少。

在实际操作中常取4～6周龄的母鼠作超排卵供体，腹腔注射孕马血清(PMS) 和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。PMS模拟卵泡刺激素(FSH)作用，hCG模拟黄体生成素(LH)的作用。二者注射时间间隔为42～48h，排卵发生在注射hCG后10～13h,注射剂量为每鼠5～10u。为了实验方便，常在下午注射PMS，隔日同一时间注射hCG，注射hCG 后每只母鼠置于一个单独饲养的正常公鼠笼内，次日晨检查阴道栓。

(2)取卵：用颈椎脱臼法处死有阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管带一小段子宫剪下,置于PBS平衡盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管伞部，用带4号针头的注射器将受精卵冲出，立即将卵子换至新鲜培养液内洗涤3～4次即可用于显微注射。

2. 注射外源DNA：显微注射需用显微操作仪，用来控制显微持卵针和显微注射针。持卵针是显微注射时固定受精卵的细玻璃管，管口平滑，通过一注射器控制持卵针，使其吸住要进行注射的受精卵。用来注射外源DNA的细注射针管表面平滑，尖端锋利,便于注射时穿过透明带、细胞膜等。取已制备好的受精卵细胞和外源DNA悬液,在倒置显微镜下做显微注射。注射时先用持卵针吸住受精卵，再用注射针吸取外源DNA悬液,然后推动注射针，使其刺入受精卵的雄原核，将DNA注入。注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入新的培养液中，使其恢复。一般50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。

3. 注射后受精卵(或胚胎)的移植：注射后单细胞至桑椹胚的卵(受精后0.5天到3.5天)移植至受孕后的0.5天的假孕鼠的输卵管，输卵管移植需用被透明带包裹的卵。也可将注射有外源DNA的受精卵或桑椹胚体外培养至囊胚，再行移植。显微注射后3.5天的囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宫，子宫移植不需要有透明带。
此法的优点是，在一定设备和经验条件下，实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直接导入原核内,导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合,其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，妨碍其表达的正常调节。

(二)逆转录病毒感染法：以逆转录病毒作载体， 把重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒，感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主的染色体内的方法称为逆转录病毒感染法。此法操作简单，可通过注射将重组病毒转移到囊胚腔内，也可将去透明带的胚胎与分泌重组病毒颗粒的细胞共培养，以达到将外源DNA 转移到胚胎中去的目的。

这一方法的优点是，重组逆转录病毒可同时感染大量胚胎。感染后的整合率高；外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝的；不需要昂贵的显微注射设备。本法的缺点是，由于选用的受体是早期胚胎，不是受精卵，致使外源DNA 在动物各种组织中的分布不均,不易整合到生殖细胞中；由于病毒衣壳大小有限,限制了被导入的外源 DNA的大小，一般不超过15Kb。

(三)胚胎干细胞介导法：囊胚的内细胞团含有未分化的胚胎干细胞。体外建株的胚胎干细胞称为EK细胞(embryonic karyotype cell)或(embryonic stem cell)。 如果将EK细胞移植到正常发育的囊胚腔中，它们能很快地与受体的内细胞团聚集在一起，参与正常的胚胎发育。用重组的逆转录病毒作为载体感染EK 细胞， 再将此EK细胞移植入受体囊胚腔，可发育成携带着特定外源DNA的个体。

采用这一方法的优点是，外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也很高。缺点是，EK细胞株不易建立，长期培养后出现细胞分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体。

(四)精子载体法 将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备， 且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。

此外，还有一些其它的方法，都有不同的优缺点。

五、转基因鼠的检测

待假孕母鼠产出幼仔后,可用幼鼠尾巴提取DNA;对于一些基因调控研究,需要尽快获得信息而暂不需保留转基因鼠，从胎鼠组织或幼鼠尾巴提取的DNA,可用PCR、Dot blot

(斑点杂交)、Southern blot(Southern转移)等多种方法分析以确定是否转基因鼠。

六、基因转移后的存在方式及表达

(一)外源基因导入后的存在方式：外源基因被导入受体细胞后，在受体细胞内的存在方式有三种：

1. 非同源重组。大多数外源基因导入受体细胞后,与受体细胞染色体的某一位点随机整合，这样可带来正常基因的插入、缺失、易位等突变。

2. 同源重组。导入的外源DNA与受体细胞染色体的DNA 通过顺序取代或顺序插入实现同源重组。通过同源重组有可能导致受体细胞正常的基因发生突变，当然，也有可能代替原来的有遗传缺陷的遗传基因，从而纠正遗传缺陷。

3. 游离存在。外源基因没有整合到受体细胞中,而是以附加体的形式游离在受体细胞内，能自我复制，并能100％的传给下一代。

(二)外源基因导入后的表达：外源基因导入受体细胞后能否表达，是受许多因素影响的。

1. 外源基因本身的结构和性质。

2. 附带的原核载体顺序。研究发现，原核载体的存在对α-甲胎蛋白、β- 珠蛋白等基因的表达具有明显的抑制作用，而对免疫球蛋白和胶原蛋白基因的抑制不明显。
3. 染色体位置。 外源基因在受体动物细胞染色体上整合部位的基因环境对外源基因表达的影响很大。

4. 甲基化。被转移的基因容易甲基化而失活。

外源基因在受体细胞中的表达方式表现为组织特异性和发育阶段特异性。组织特异性表达是由于某些调节元件如启动子和增强子的作用造成的。比如，免疫球蛋白基因只在B细胞中表达，原因是免疫球蛋白基因的启动子只存在于B淋巴细胞内，这是一类只在专一细胞中表达的启动子；另有一类可在多种组织细胞中表达的启动子，比如，人生长激素基因分别在肝与肾、淋巴器官和肌肉中表达。发育阶段特异性表达是指转基因在个体发育中的表达具有严格的时空特性，受到精细的调控。