细胞培养的污染及控制

污染的类型

细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。

一、细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。

培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。

二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。

三、支原体污染

支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。

培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。

四、病毒污染

采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞和会发生变异、转化，形成异倍体的细胞系。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。

五、非同种细胞污染

由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的，而现在句却认为是HeLa细胞。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

污染来源及鉴别

一、污染来源

细胞培养过程中污染的来源主要有以下几条途径：

1、不洁的动物组织标本

很多动物组织本该是无菌的(直接与外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系统除外)，但由于取材时不小心也会有污染的机会。组织本身含有细菌，如取材时不用浓的抗生素洗液洗涤浸泡，也会带菌，造成细胞污染。

2、空气

空气中含有大量的微生物，如果操作室与外界隔离不严或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，净化工作台使用过久，滤板未定期更换或长久不更换，滤气受尘埃堵塞，工作时不带口罩或外界气流过强，污染空气进入操作区，也会导致污染。春夏季南方地区多雨，空气湿度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

3、清洗消毒

培养用物品、材料洗刷不净，培养用液和器材灭菌不彻底也会引入微生物和有毒物质。

4、操作

来自操作者的污染主要有以下几方面：

（1）器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过，或者是否已经消毒灭菌处理过，或者虽经处理，时隔已久又末重新处理。

（2）操作者未戴口罩、帽子，呼出气中排出细菌和支原体。

（3）培养瓶口未用75%酒精擦和烧灼。

（4）操作者不当心，动作不正确而将吸管或无菌器具碰到了污染的物品，如手上皮肤和瓶子外壁等。

（5）操作者操作时大声说话，来回走动扬起灰尘等。

5、血清

市售血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染。

二、污染的鉴别

1、细菌、真菌污染的检测

（1）肉眼观察 细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48小时内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。

（2）镜下观察 在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。

（3）接种观察 采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可发现是否有污染。

2、支原体污染的检测

（1）相差显微镜观察 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁尘镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。

（2）低涨处理地衣红染色观察 取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞。用新配制的Carnoy液固定两次，每次10分钟，取出盖片凉干。用培养液时，先吸取1mL，500～800r/min离心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分钟，加入Carnoy液固定，离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3张涂片。然后用2%醋酸依地红(地衣红2g，冰醋酸60mL，加蒸馏水至100mL)染5分钟。纯酒精过三次，每次1分钟，封入Euparal或树胶中。若染色过深，可先用75%酒精脱色，再封片。镜下观察见支原体呈暗紫色小点，位于细胞外或细胞之间。

（3）荧光染色法观察 用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，然后用荧光显微镜观察。染色方法为：用支持物盖片培养法将细胞接种在盖片上，在细胞汇合前（即未长满前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚红的Hanks液漂洗，1:3醋酸钾固定10分钟，再用生理盐水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258(生理盐水配制)中染色10分钟，置于蒸馏水漂洗1～2分钟，向细胞面滴加数滴pH5.5磷酸缓冲液，然后置荧光显微镜下观察。若用细胞培养液，先离心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，离心弃上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分钟，再用生理盐水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分钟，加入蒸馏水漂洗，离心去上清蒸馏水，加3～5滴pH5.5磷酸缓冲液，稍吹打使沉淀细胞重悬浮，用吸管吸出，滴于载物片上，盖上盖片后观察。荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

（4）电镜检测 若条件许可，可用扫描电镜或透射电镜观察。一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行。需经过固定、包埋、切片后才能进行观察。详细方法同细胞形态观察法（见第九章）。

（5）培养检测 将2.5×109/L细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基（Sigma或北京生物制品所生产的均可），培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

污染的清除和预防

一、污染的清除

培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。

1、使用抗生素

抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素(青霉素100u/mL加链霉素100μg/mL)，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品种除青霉素、链霉素外，还可用庆大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四环素、制霉菌素等。常用400～800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四环素处理，每隔2～3日换液1次，传1～2代进行治疗。近年来有报道，4-氟，2-羟基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilin derivative, BM-Cyclin2:BM-1和四环素衍生物(BM-2)等三种抗生素单用或合用对杀灭支原体有效。这三种抗生素均用PBS配成250X浓缩液，-20℃保存备用，使用浓度Cip为10μg/mL，BM-1为10μg/mL，BM-2为5μg/mL。使用时先吸除污染的培养液，加入含BM-1的RPMI1640培养液，3天后再吸除培养液，加入含BM-2的RPMI1640培养液，培养4天，如此连续3个轮次，直至用33258荧光染色镜检证明已清除支原体后，再加正常培养液培养传代3-4次。

2、加温处理

将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。所以在处理前要进行预试验，摸索能最大限度杀死支原体又对细胞影响最小的加热时间。此法有时不可靠。若先用药物处理后，再以41℃加温处理效果更佳。

3、使用支原体特异性血清

用5%的兔支原体免疫血清(血凝效价1:320以上)可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。

4、其他方法

除了上述去除污染的方法外，还有动物体内接种除菌法、巨噬细胞吞噬法、污染培养瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及过滤法等，但均较麻烦，且效果不确定。所以一旦支原体污染，除非有特别重要价值，一般均弃之重新培养。

二、污染的预防

预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：

1、从物品、用品消毒灭菌着手

细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。

2、从操作者做起

（1）操作者责任心要强，要细心稳重，操作技术要熟练。进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5分钟，按规定穿隔离衣。进入后关好门，坐下来尽量少走动。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。

（2）操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。

（3）操作时要常更换吸管，切勿一根吸管做到底。一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用消毒水浸泡的纱布擦台面。

3、防止细胞交叉污染

在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。

在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。

所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。