Abstract
Chaperones (stress proteins) are essential proteins to help the formation and maintenance of the proper conformation of other proteins and to promote cell survival after a large variety of environmental stresses. Therefore, normal chaperone function is a key factor for endogenous stress adaptation of several tissues. However, altered chaperone function has been associated with the development of several diseases; therefore, modulators of chaperone activities became a new and emerging field of drug development.
Pharmacologically 'bribing' the essential guard duty of the chaperone HSP90 (heat-shock protein of 90 kDa) seems to offer a unique anticancer strategy of considerable promise. Hsp90 inhibitors are unique in that, although they are directed towards a specific molecular target, they simultaneously inhibit multiple cellular signaling pathways. By inhibiting nodal points in multiple overlapping survival pathways utilized by cancer cells, combination of an Hsp90 inhibitor with standard chemotherapeutic agents may dramatically increase the in vivo efficacy of the standard agent. Hsp90 inhibitors may circumvent the characteristic genetic plasticity that has allowed cancer cells to eventually evade the toxic effects of most molecularly targeted agents.
Interestingly hsp90 have much thing to do with the evolutionary.
Keywords: 热休克蛋白90(hsp90) ,分子伴侣 ,癌症，生物进化,格尔德霉素
1.简介
分 子伴侣(chaperon) 是最近十几年才发现的一类非常保守的蛋白家族。它与酶的作用方式类似，能和某些不同的多肽链非特异性结合，催化介导蛋白质特定构象的形成，参与体内蛋白质的折叠、装配和转运，但又不构成其结构的一部分。这类保守的蛋白家族大致可分为四大类，广泛存在于生物体中。其中研究得最多的是 热休克蛋白。实际上，分子伴侣是一种蛋白质分子构象的协助者，主要参与蛋白质次级结构的形成。在所有的分子伴侣中，HSP90在多种多肽的生物产生过程中 不是必需，但是其的许的细胞底物或作用蛋白是构象不稳定的信号转导子，后者在生长调节，细胞存活以及发育过程中发挥着至关重要的作用，所以是最重要的一类分子伴侣。hspg0家族成员存在于从细菌到人的整个生物界．其分子量范围在80~90kD之间，目前己对许多进化程度不同的生物的hsp90家族成员进 行了基因的克隆及序列分析，尽管各物种的成员数目及分子量有差别，但在分子进化上是相当保守的．从E.coli到人竟有5％ 同源性。
尽管未发现它们具有任何酶的活性．但在许多真核细胞内却发现它们与细胞内许多功能蛋白相互关联。真核hsp90分子内有一高密度负电荷区， 它本身序列保守性很小 但处于蛋白的同一相对位置上。该族所有成员(包括原核细胞)的蛋白羧基端含有另一负电荷区．该区具有很高的变异度，但C一末端4个氨基酸(glu- g1u- val-asp)在所有真核细胞的hsp90中却相同，这一区域所起的作用还不清楚。
需要指出的是，虽然HSP90具有极其重要的生物活性，但它并不是单独发挥效用的，其往往与HSP70形成二聚体，以合分子伴侣（cochaperon）的形式发挥生物活性。
2.HSP90与物种进化
在物种进化问题上，物种起源一直是人们普遍关注的问题所在．近年来这方面的研究已经有所发展，有多种假说提出，与此同时人们正努力从实验上证明这些假说． 例如：人们在小鼠身上的研究得出结论：几乎在脊椎动物刚出现时，HSP90的同源物(SP90a和HSP90[~)就在基因复制出错时产生．这种说 法得到许多人的支持，并通过对大麻哈鱼、斑马鱼等硬骨鱼的基因序列研究结果，进一步支持这种假说．HSP90a和HSP90~是结构高度相似的一对同源 物，但是它们却是不同基因表达的产物．在人类、老鼠、和小鸡体内，这对同源物有大约85的氨基酸序列是相同的，然而在比较物种间的同源形式时发现，它们之间存在更大的相似性，例如，人类的 HSP90a与小鸡、大鼠、猪的HSP90a有着95 ～99 的相同部分，而HSP90~也有94 ～99 的序列和小鸡、小鼠是相同的．这在进化上是个有趣的发现，经过研究，发现HSP90a和HSP90~的定向进化在四足动物出现时产生分支，这可以说明 HSP90的起源比脊椎动物的形态进化来得早．有人在此基础上，通过HSP90的序列比较，做出一系列系统进化树。
目前已有许多研究证实HSP90在形态进化中起作用，但一般都认为HSP90是作为“突变容器”发挥作用．例如，Rutherford等认为HSP90可以缓冲物种的表型变化，即自然选择能增加物种的遗传多样性，在HSP90的调节下，机体的表型变化一般不立刻表现出来，直到当物种的环 境受协迫时，这种变化才表现出来．相应地，当机体受协迫时，HSP90参与某种机制使中性突变转变成选择突变，由此适应选择的需要．换句话说，HSP90 可以在选择压力下影响基因表达，通过调节突变的蛋白正确折叠，或是间接地通过调节信号转导缓冲开始变化的表型，使不利于环境的形态基因不能立刻表达，而隐 藏的有利基因得以表达．Christine QueitschL等通过实验进一步支持这种说法．他们还提出，在自然选择压力下，HSP90的缓冲作用能促使种群进化成不同的基因型，从产生某个性状开始，到对环境压力有作用的性状，到固定的、长期的表型．HSP90能缓冲进化中的随机事件的影响，这些随机事件往往能引起进化过程中的决定性变化． 总之，HSP90能促使遗传物质变化朝某一特定性状发展，这在进化过程中往往是有利的，特别是在环境变化的时候．
3.HSP90的生物效应
HSP90 与细胞的转化密切相关。在癌基因转化的细胞和人类恶性肿瘤细胞系中．HSP表达增高；酪氨酸激酶抑制药格尔德霉素(见后)能通过破坏HSP90与 pp60v KI'C复合物的形成而使肿瘤细胞逆转：抑癌基因发挥抑癌作用有赖于它与HSP的结合，如抑癌基因P53与HSP70、HSP90的结合能抑制肿瘤的发生与生长。此外，fes、fps、yes、 等转化蛋白也可与HSP90结合，通过肌动蛋白将其定位于细胞骨架上，以介导细胞的转化诱发肿瘤的发生。
另外HSP与肿瘤的侵袭、新生血管生成和转移相 关。HSP90也可以影响新生血管生成，它可以在多个层次不同程度地破坏新生血管生成过程中很多关键的信号级联反应 。HSP90参与对肿瘤细胞周期的调控。HSP90活性被抑制后可以使乳腺癌细胞株停滞在Gl期，而且这种阻滞的发生依赖于细胞内Rb的表达，并最 终会导致细胞分化或凋亡。HSP以直接或间接的方式参与了细胞凋亡的调节，其作用靶点涉及不同凋亡信号通路的各主要激酶或关键性调控蛋白。
除对凋亡 相关信号转导通路的蛋白质直接调节作用之外，还涉及了一些细胞膜生长因子受体，如EGFR、ErbB2、FLT3及细胞内雌、雄激素受体等蛋白质稳定性和 活性的调节，这种调节作用具有双向性。即既有抗凋亡的作用，也有促凋亡的作用。细胞凋亡分为线粒体通路介导的凋亡及死亡受体通路介导的凋亡，而HSP不同 程度地对这两条通路的活化具有调节作用。Hsp90能过阴断Apaf-1寡聚化，最终阴断凋亡体的形成。但也有不少研究认为，HSP具有促凋亡作 用。
新近的研究表明HSP90和辅助伴侣分子p50ede37还参与了对JNK及p38上游激酶MLK3稳定性和活性的调节，当HSP90功能受到抑制 时，MLK3激酶水平明显降低N诱导的MLK3及JNK的活化随之被阻断：这一结果提示可能一些促进凋亡的蛋白质同样受到HSP90伴侣功能调控。 TNF可以启动3种不同的信号转导通路。即NF．zB通路和JNK通路的活化及诱导细胞凋亡，在TNF诱导的NF．zB通路活化的过程中，需要形成由胞内 重要的受体交互作用蛋白，而HsP90可以通过维持此蛋白的稳定性，提高NF.zB的活性，介入阻断TNF诱导的细胞凋亡，此外HSP90还可以通过调节 AKT激酶而间接影响NF.KB的活性。
Hanahan and Weinberg总结正常细胞向癌细胞的转化需要在细胞生理上有6个基本的变化标记，包括生长信号的自足作用，抗生长信号的不敏化，细胞凋亡的逃脱，无限的增殖潜能，持续的血管生成能力以及组织入侵和转移。因为计多HSP90的作用蛋白在以上各方面中都发挥着重要作用，HSP90的靶向治疗潜能最好考虑对癌细胞那六个标记的同时靶向作用，如图1所示：
Fig. 1. Hsp90 and the six hallmarks of a cancer cell. Multiple Hsp90 client proteins mediate acquisition and maintenance of the six properties necessary for transformation of a normal cell into a cancer cell: (a) ability to evade apoptosis, (b) ability to be self-sufficient for growth, (c) ability to invade surrounding tissue and to metastasize to distant sites, (d) ability to undergo limitless replication, (e) ability to promote neoangiogenesis, and (f) ability to not respond to antigrowth signals. IGF-1R, IGF-I receptor; HIF, hypoxia-inducible factor; RTK, receptor tyrosine kinase; MMP2, matrix metalloproteinase-2. Reprinted from Hanahan and Weinberg (10) ©2000, with permission from Elsevier.
HSP90除了在多种癌症中都有表达外，如结肠癌，胃癌，肝癌，同时在一些白血病和SLE中也有表达，提示HSP90可 能与多种疾病的产生有密切关系。另外也有报道HSP90与内皮型一氧化氮合酶的激活有关，提示HSP90在体内有着广泛的生物活性功能。
4.HSP90的临床评价
虽然HSP90的调节功能提代了一个治疗癌症有效方法，但是该方法的可行性和有效性仍在临床实验中。HSP90在细胞内主要以二聚体形式存在，每个亚单 位由三个功能结构域构成：一个N-端ATP结合域;一个中段域;以及一个包含四肽重复模块的C-端二聚体域。格尔德霉素（GDM）和根赤壳菌素 （RDC）是已知的对HSP的N-端有强列抑制作用自然产物（775nM for GDM ,27nM for RDC）.这些自然产物与ATP竞争，后者是HSP90 N－端结构域自然底物。
它们对一系列癌细胞系表现生长抑制活性，包括人类乳腺癌细胸，如MCF-7（49nM for GDM,23nM for RDC）。虽然作为药物GDM和RDC有一定的缺点，但GDM的17－丙烯胺衍生物（17AAG）和17－二甲基胺乙基衍生物（17-DMAG）目前已作 为单药剂用于二期试验，同时与细胞毒性药物的联合作用也在研究中。8，9－二代嘌呤类分子，如 PU3，是最先完全合成的HSP90抑制剂，其可以与HSP90N-端的ATP结合点结合。这一类的合成抑制剂在细胞降解Erb B2激酶,ER 和 C-Raf激酶后仍具活性;然而，这些活性与GDM和RDC相比起来就弱多了。三种抑制剂结构如图二。
在 所有的动物药理研究中，两个17-N-丙烯胺-17-去甲氧基格尔德霉素17-N-allylamino-17- demethoxygeldanamycin (17-AAG)活性重要的潜在调节单位已被鉴定。肝中的17-AAG代谢主要通过细胞色素P450（CYP450）酶催化17-氨基，17-去甲氧基格 尔德霉素（17AG）产生，后者可保持HSP90抑制活性。
为了减小变异，患者使用已知CYP450系统诱导剂对17AAG的临床试验已被禁止。一个最近 的17AAG一期试验报道显示CYP3A5多态性伴随着药物清除率的变化，但无总体毒性作用。醌还原酶NQO1J有在细胞培养中代谢17AAG至对 HSP90更大抑制作用。但是，NQO1中的多态性并不影响17AAG的药物动力学或全身毒性，至少在目前为止报道的那一小群病人中没有发现 。
图2.三种 HSP90 N-端结构域抑制剂结构式
对基于HSP90的靶向药物研究也有广泛的争议，因为HSP90是很重要的分子伴侣，对它的抑制也会产生对正常细胞损伤的副作用。相似的争论也在蛋白酶全 抑制剂的发展中出现，但是，它确有抗癌活性，尤其是骨髓癌。基于一期试验结果，可见给病人可接受的毒性水平的17AAG，药物动力学调整HSP90作用蛋 白可通过药物诱导实现。有趣的是，在他们的试验中骨髓抑制作用不是一个剂量限制性的毒性作用，这可以支持将HSP90抑制剂与常规毒剂联合作用以治疗疾病 在将来的可靠性。因为17-AAG是第一个被发现的该类抑制剂，而试验目前仍处于临床二期，癌症病人的临床反馈信息是有限的。现已知的药物作用主要是稳定 病情，主要在恶性骨髓瘤，这与细胞抑制类药物效果一致。
5.HSP90的前景展望
因为距HSP90的发现已有10多年了，在研制HSP90作为抗癌药的过程中取得了无数的突破。这些化合物也证实HSP90复合物在各种生物过程中的重要作 用。然而在癌症治疗领域，HSP90的作用仍面临两大挑战。首先是提高现有药剂药理性质同时保持特异的靶向性。虽然这个问题不是小事，但是正进行的各种各 样的研究和目前该领域取得的成果提示有极高的解决可能性。其次，更具挑战性的是找到更合适的研发治疗癌症的HSP90抑制剂的方法。
除了在极少的特定环境 外，几乎不可能证明HSP90就是癌症中导致细胞减少的主要药物。除此以外，它们已知的生物活性以及早其的临床结果均提示它们更重要的是作为其它治疗药物 对癌症作用的调节单位。它们也可能是有效调节肿瘤内在发展能力的因子，而这是目前治愈治疗的主要障碍。已知HSP90在“保护”蛋白酶体的重要意义，那就 可以确保安全地说HSP90在癌症靶向治疗中有如上所说的意义。
