质粒DNA纯化

试验原理:

大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化,常用柱层析法和氯化铯梯度离心法。常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如,用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合,进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后,超螺旋度大为增加, 从而阻止了溴化乙锭分子的继续嵌入。但线状分子不受此限,可继续结合更多溴化乙锭,直至达到饱和( 每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子) 。

由于染料的结合量有所差别,线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来,氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时,为此发展了许多替代方法。

其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。尽管这些方法大多数均被束之高阁,但其中最好的方法,也应是聚乙二醇分级沉淀法,最近已得到改进(R.Treisman,个人通讯)并达到较高境界, 使用该方法可得到极高纯度的质粒。聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同,那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开,因此, 纯化容易带上切口的极大质粒(大于15kb)及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。 然而, 两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA,包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。

氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA

连续梯度:

1、测量DNA溶液的体积,按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl, 将溶液加温至30℃助溶。温和地混匀溶液直到盐溶解。

2、每10mlDNA溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液(10mg/ml溶于水);立即将溴化乙锭溶液(漂浮在表层)与DNA-氯化铯溶液混匀, 溶液的终密度应为1.55g/ml(溶液的折射率为1.3860)溴化乙锭浓度大约740μg/ml。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内(如用锡箔完全包裹的瓶子),于室温保存。

3、室温下用Sorvall SS34头(或与其相当的转头)以8000rpm离心5min, 浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。

4、用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到离心管中。用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。

5、以20℃对所得的密度梯度以45 000rpm离心16h(VTi65 转头)、以45 000rpm离心48h(Ti50转头)、以60 000rpm离心24h(Ti65转头)或者以60 000rpm离心24h(Ti70.1转头)。普通光照下,在梯中心可见两条DNA区带, 上部区带材料通常较少,由线状的细菌(染色体)DNA和带切口的环状质粒DNA组成:下部区带则由闭环质粒DNA组成。管底部深红色的沉淀是溴化乙锭RNA复合物,位于CsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。Beckman Quick-Seal离心管中的CsCl-溴化乙锭梯度可容纳4mg 闭环质粒DNA而不至超负荷。如有更大量的质粒存在,将扩展为一条宽带,并与染色体DNA相重叠。这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现,只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现负荷,可收集整个DNA区高产水平时才会出现,只要将该质粒提取物分为2个梯度即可解决。如出现超负荷,可收集整个DNA区带,用CsCl溶液(ρ=1.58g/ml)将体积调到15ml,在两个离心管中再度离心,使DNA达到平衡。

6、收集DNA带。将21 号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入,为尽量减少污染的机会,首先用18号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带(杂色体DNA):用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂,然后将一块Soctch胶带贴于管外壁。穿过Soctch胶带将18号皮下注身针头(其斜面向上)插入管中,以便使针头的斜面开口恰好位于染色体DNA区带之下并与该区带相平行。将粘稠状DNA收集到一次性使用的管内,用造型粘土块封住皮下注射针头的未端并将第2根针头留于原处。 穿过Soctch 胶带插入第3根皮下注射针头(18号),将下部的质粒DNA区带收集到玻璃或塑料管中。

不连续梯度:

该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中,这样可以加速CsCl梯度的形成,使离心时间减少到6h。

1、将125gCsCl加到167ml(pH8.0)中,制成CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)。

2、将8ml氯化铯溶液加到Beckman Quick-Seal 离心管(或与其相当的管)中,待用。

3、如有必要,可酌情用TE(pH8.0)将质粒DNA溶液的体积精确地调到3ml。

4、在质粒DNA溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解, 小心地混匀溶液直至盐溶解。

5、称量溶液重量并加入TE(pH8.0)直到溶液重量恰好达13.2g,用天平称量时应注意去除管的重量。

6、加入0.8ml溴化乙锭溶液(10mg/ml溶于水),快速混匀溶液直至染料均匀地分散,此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。小心:溴化乙锭是一咱强诱变剂,并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。【溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内(如用锡箔完全包裹的瓶子),于室温保存。】

7、室温下,用Sorvall SS34转头(或与之相当的转法)以8000rpm离心5min,浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙2锭和细菌蛋白所形成的复合物。

8、将22.86cm的巴期德吸管放入装有CsCl(步骤b制备)的离心管中, 吸头应接触管底。用吸管小心地将步骤g所制备的清亮红色溶液(来自浮渣之下)加入管内,使样本层位于CsCl溶液(1.47g/ml)之下。如有必要,可酌情将步骤a中制备的CsCl溶液(ρ=1.47g/ml)添满离心管,封口。

9、将封口的管,(与相应的平衡管一起)放入Beckman Ti70. 1 或Sorvall65.13转头(或与之相当的转头中),于20℃以60 000rpm度离心6h。

10、回收闭环质粒DNA区带。

从经过纯化的质粒DNA中去除溴化乙锭

溴化乙锭是一种强诱变剂,并有中度毒性。接触含有该染料的溶液应戴手套。

有机溶剂抽提:

用后溶液应用下面的步骤进行净化处理。

1、将DNA溶液放入玻璃或塑料管中,加等体积的水饱和1-丁醇或异戊醇。

2、振荡混合两相。

3、用台式离心机,室温下以1500rpm,离心3min。

4、用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。

5、反复抽提[步骤a-d]4-6次直到粉红色从水相和有机相中均消失。

6、用以下任意一种方法从DNA溶液中除去CsCl:通过微量浓缩器(Amicon)进行旋转透析,对TE(pH8.0)透析24-48h,并换液数次或者用3倍体积水进行稀释并于4℃用2倍体积乙醇(即终体积相当于原未稀释体积的6倍)沉淀15min,再以4℃,10 000rpm 离心15 min, 将沉淀的DNA溶于约1ml TE(pH8.0)中。如果将DNA的乙醇溶液置于-20℃,CsCl会沉淀。

7、测定DNA最终溶液的OD260值,计算DNA的浓度, 将DNA分成小份贮存于-20℃。如果制备的DNA含有显著量的溴化乙锭(依颜色判断),可用酚、酚:氯仿各抽提1次,然后用乙醇沉淀DNA。

溴化乙锭溶液的净化处理:

溴化乙锭是强诱变剂,并有中度毒性,取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套,这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。

溴化乙锭浓溶液(即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液)的净化处理:

用沙门氏菌-微粒体测定表明, 本方法(Lunn 和Sanaone,1987)可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。

1、加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。

2、加入0.2体积新配制的5%次磷酸和0.12体积新配制的0.5mol/L 亚硝酸钠,混匀。【检测该溶液的pH值应小于3.0。市售次磷酸一般为50%溶液,具有腐蚀性,应小心操作,必须现用现稀释。亚硝酸钠溶液(0.5mol/L)应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml,现用现配。】

3、于室温温育24h后,加入大大过量的1mol/L碳酸氢钠。至此, 该溶液可予丢弃。

溴化乙锭希溶液的净化处理

方法一:

1、每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm和Haas 公司购置。

2、于室温下放置12h ,不时摇动。

3、用 Whatman 1号 滤纸过滤溶液,丢弃虑液。

4、用塑料袋封装滤纸和Amberlite 树脂,作为有害的废物丢弃。

方法二:

1、每100ml溶液中加入100mg 粉状活性炭。

2、于室温放置1h,不时摇动。

3、用 Whatman 1号 滤纸过滤溶液,丢弃虑液。

4、用塑料袋封装滤纸和活性炭,作为有害的废物丢弃。

从质粒DNA制品中去除RNA

对于某些用途(例如用BAL31进生活化或用T4噬菌体多核苷酸激酥标记质粒DNA的限制切片段的5'端),必须获得无RNA污染的DNA制品。尽管在通过氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒DNA中,这样的RNA污染物的质量很少,但其中的RNA分子数却可能相当可观,并可在限制酶消化反应的全部5'端中占据较大的比例。通过下述方法,可以从质粒制品中去除RNA。通过Bio-Gel A-150m或Sepharose CL-4B进行层析

1、制备质粒DNA。

2、有等体积的经TE(pH8.0)平衡后的酚抽提1次。

3、将至多1ml的水相铺在经TE(pH8.0)和0.1%SDS平衡的Bio-Gel A-150m或Sepharase CL-4B(1x10cm)柱上。

4、将DNA装入层柱并在柱的上部连接上含0.1%SDS的TE(pH8.0)的贮液瓶,立即开始以0.5ml流出液为1流进行收集。

5、当收集到15份时,关闭柱底部,为明确质粒DNA的分布情况,可在每份收集物中取10μg样品,通过0.7%琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光进行分析。

6、将含质粒DNA的组成合并在一起,加2倍体积的乙醇于4℃沉淀10min,然后以4℃大于10 000rpm离心15min,以回收DNA。