化学发光及生物发光的原理及其应用

一、发光物质的类型

（一）无机化合物化学发光分析

1、金属离子分析

痕量金属离子对化学发光反应具有很好的催化作用，因而化学发光测定金属离子得到广泛的应用 ( 见表 1) 。但是，由于不同金属离子催化氧化发光试剂时，发光光谱相同，致使金属离子催化化学发光反应的选择性较差。为提高分析的选择性，可采用以下方法 :

(1) 利用待测金属离子与干扰离子配合物稳定性不同进行选择性分析，如加入掩蔽剂 EDTA 或水杨酸掩蔽干扰离子 ;

(2) 优化实验条件以减少其它离子的干扰 ;

(3) 稀释样品溶液 ;

(4) 加入敏化剂。但是，当样品中待测物相对于干扰物浓度很小时，上述方法也无济于事，只得进行前处理，常用的分离方法有色谱、溶剂萃取等。

色谱分离的高选择性与化学发光检测的高灵敏度相结合，是一种很有前途的联用技术。关键是流动相的选择，流动相选择得好，不仅可以提高选择性，还可以进行多个离子的同时测定。如用离子交换分离法同时测定 Cr (à ) 和 Cr (? ) 。溶剂萃取也是提高化学发光测定金属离子选择性的一个有效方法。这种方法的主要问题是费时，因为进行化学发光检测前必须将无机物从有机溶剂中反萃取出来，或是将有机溶剂蒸发除去。较好的方法是自动在线溶剂萃取选择性检测待测物。

2、其它无机化合物的分析

化学发光反应中，过氧化氢是最常用的一种氧化剂，因此有关 H 2 O 2 化学发光分析的报道较多 ( 见表 2) ，涉及到鲁米诺、过氧草酸酯及光泽精等化学发光反应。根据鲁米诺化学发光反应制成的 H2O 2 光纤传感器与流动注射法联用，可检测 10nmo l ／ L ～ 1 mmo ／ L 的 H 2 O 2 ，用模拟酶代替辣根过氧化物酶催化鲁米诺发光，检测限可达 5 . 5×10 － 9 mo l ／ L 。根据 ClO - 对鲁米诺的氧化作用，可用于测定 ClO - ，其它物质如 Cl 2 的干扰，可用流动注射法消除。利用停流技术测定水中 ClO - 不必进行前处理。含氮的无机化合物如 NH3 ／ NH 4 ，可将其衍生后用 TCPO 化学发光法检测，线性范围为 2 。 9ug ／ L ～ 6 m g ／ L 。 CN － 能抑制鲁米诺 H 2 O 2 － Cu (II ) 的化学发光，据此可分析测定 CN — 。在低温条件下化学发光分析测定 CN － ，当进样量为 100uL 时，线性范围为 10 － 9 － 10 -7 g ／ mL ，当进样量 20 uL 时，线性范围为 10 － 8 ～ 5×10 -7 g ／ mL 。

（二）有机化合物的化学发光分析

1、有机酸

有机化合物的同系物结构和性质相似，使单一组分的测定遇到困难，因此有机化合物同系物的分析常与 HPLC 相结合。有机酸的化学发光分析 ( 见表 3) ，一般是先将其衍生成荧光物质经色谱分离后进行化学发光检测。但衍生法有如下的缺点 :

(1) 衍生反应不完全 ;

(2) 衍生物稳定性差，要求及时检测 ;

(3) 限制了分离方法和条件的选择。

由于衍生产物的性质与待测物不同，导致分离效率和分辨率下降，同时增加分析的时间和劳动强度。在临床医学上，草酸是一个重要的检测项目，可以直接用氧化化学发光反应测定尿液和草酸二乙酯中的草酸盐及游离的草酸。另外还可以测定苯酮尿症病人的尿液的苯丙酮酸的含量，方法是先在碱性条件下将苯丙酮酸氧化成 1 ， 22 二氧杂环丁烷类化合物，然后裂解产生化学发光。另外可以将 Fe （ III ）草酸配合物光解得到 Fe (II ) ，催化鲁米诺－过氧化氢化学发光反应，此法线性范围为 0 . 1 ～ 100uM 。此外酶联偶合反应也可以用于某些有机酸的化学发光分析.

2、有机碱

胺类化合物第一离子化电势呈如下规律 : 伯胺 > 仲胺 > 叔胺，并随碳链增长，离子化电势逐渐下降，因此叔胺化合物的检测限较低，达 0 . 28 pM 。胺类化合物的分析 ( 见表 4) ，较多的是经柱前衍生生成荧光衍生物，分离后用过氧草酸盐化学发光体系检测，也可将其生成希夫碱或其它产物氧化而发光。有些碱如肾上腺素等可直接氧化而发光。通常有一个经验规则，假如一物质具有荧光或其反应产物有荧光，该物质一般可发生化学发光反应，但也有例外。嘌呤碱是核酸的基础物质，因此对嘌呤碱的分析测定将推动 DNA 分析方法的发展。在酸性醇液中腺嘌呤与苯甲醛反应，然后用过氧化氢氧化反应产生化学发光，此法具有很好的选择性，线性范围为 1 . 5×10 － 7 ～ 5 . 0×10 － 7 M ，用此法测定鸟嘌呤灵敏度比荧光法高 20 倍。

3、氨基酸

氨基酸分析方法的改进有利于推动生物技术、基因工程、 DNA 重组和基因克隆等的发展。由于绝大多数氨基酸没有内源荧光特性，因此用过氧草酸盐体系测定氨基酸需将其衍生成荧光物质，但此法避免不了衍生法所固有的缺点。此外亦可通过测定氨基酸与氨基酸氧化酶反应产生的过氧化氢来测定氨基酸的含量，如 L 2 氨基酸经反相色谱柱分离后流经 L 2 氨基酸氧化酶反应器产生过氧化氢，然后用过氧草酸盐体系检测。氨基酸与 Ru (b ipy) 3 3 反应，用流动注射化学发光法检测，相对于脯氨酸和天冬酰胺检测限可分别达到 20 pmo l 和 50 pmo l 。一般来说，仲胺反应产生的的发光强度比伯胺大。对氨基酸上取代基性质研究表明，给电子基有利于增强化学发光强度。

4、糖类

光泽精体系可用于测定一些还原性物质，如乳糖、葡萄糖，用于抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的分析测定有很高的灵敏度。但此法用于复杂样品分析却因干扰多而受到限制。用草酰胺化学发光照相法测定了葡萄糖。在微量滴定板上将草酰胺发光剂、荧光增感剂及 50 uL 试样混合，于 5 m in 内用照相荧光剂测定液斑的发光强度，可检出 100 pmo l 的萄萄糖。

糖类物质测定的另一个重要方法是测定酶反应产生的 H 2 O 2 ，由此对酶底物 —— 葡萄糖、乳糖等进行测定。而酶的固定化技术为此法的发展注入了新的活力。采用物理包埋法将葡萄糖氧化酶固定在聚丙烯酰胺凝胶中并制成酶柱，再将酶柱接入流动注射系统中，用流动注射化学发光法测定由酶促反应产生的 H 2 O 2 ，从而测定人体血液中的葡萄糖，检出限可达 0.1 m g ／ L 。

5、类固醇与类酯

一些特异性酶如类固醇脱氢酶和其它荧光素酶与合适底物反应产生 H 2 O 2 ，通过测定 H 2 O 2 达到分析测定底物的目的。

6、 药物

根据药物的不同类型选择不同的化学发光分析方法。目前较常用的方法是直接氧化化学发光。在碱性溶液中用 N －溴代丁二酰亚铵氧化含有酰胺基的药物产生化学发光，如利福霉素等检测限在 1 . 23 m g ／ L ～ 0 . 5 g ／ L 之间。氧化四环素类药物检出限在 0 . 02 － 0 . 04 m g ／ L 之间。

二、化学化光在生物领域的应用

化学发光在生物学领域也有着很多应用，主要简介如下：

1、 Fe 2

离子催化的化学发光自由基启动的脂质过氧化 (L PO) 是一个链式反应过程。 在链式反应过程中， Fe 2 离子起着启动和催化的作用。 反应过程中产生脂自由基 (R － ) 、烷氧自由基 (RO － ) 、共轭二烯和脂过氧化自由基 (ROO － ) 等中间产物。 ROO － 自反应会产生激发的烷氧自由基 (RO 3 ) 和单线态氧 (O 2 ) ，其回到基态时产生发光。 另外，两个 O 2 分子相互作用也可产生发光。

因此，把 Fe 2 盐加入含有脂肪的系统中，如细胞膜、线粒体、微粒体、血浆、组织匀浆、尿液等，可产生化学发光。 化学发光的动力学曲线，可分为快速闪光期、潜伏期、缓慢发光期和稳定发光期。有报告提出，快速闪光期的发光强度与样品中过氧化氢含量有关，潜伏期的长短与样品中抗氧化剂含量有关，而缓慢发光期和稳定发光期的发光强度则反映了系统的过氧化水平，即系统产生活性氧的能力。

2、血浆和血清的化学发光

许多实验研究对加入 Fe 2 盐的不同疾病患者血浆和血清的化学发光进行的测量表明，与正常健康人相比，腹腔器官局部缺血、肢端闭合性局部缺血、血氧含量下降以及出血、手术性休克病人血浆和血清的发光强度降低。 与此相反，风湿性关节炎、阑尾炎、胆囊炎、胰腺炎等炎性疾病患者血浆和血清的发光强度升高。 降低和升高的幅度与疾病的严重程度有关。 有研究提出，利用此方法有可能对非典型的心肌梗塞和腹腔器官炎性疾病做出区别诊断。

3、血浆脂蛋白的化学发光

有研究提出，以分离的血浆脂蛋白悬液作为系统模型可以研究不同物质对系统过氧化的调节机制。在分离的血浆脂蛋白悬液中加入胆固醇，温育一定时间后在加入 Fe 2 盐，测量化学发光，发现胆固醇能使系统的发光强度降低。分析认为，这可能是由于类固醇的存在抑制了系统的过氧化。对实验性胆固醇过多血症家兔和动脉粥样硬化早期病人进行的测量发现，载脂蛋白 APO – B 。在 Fe 2 存在条件下的发光强度出现了增长。同样的现象在肝硬化和慢性肝炎患者身上也被发现。

4、 尿液的化学发光

利用尿液的化学发光可以研究肾脏功能的变化。将 Fe 2 盐加入尿液中，测量其化学发光，发现肾功能不足者尿液的发光强度降低。与正常健康人相比，阑尾炎患者尿液的发光强度则有不同程度的提高。利用这一方法可以评估肾脏的排泄及收缩功能。

5、 物质抗氧化活性的测定

利用发光测量技术可以评价某些生物组织和体液的抗氧化活性。以某一稳定的发光系统为模型，如脂肪体、线粒体、卵黄脂蛋白等，将待测的抗氧化物质加入该系统，然后加入 Fe 2 盐，测量其化学发光。 根据系统化学发光被抑制的程度可以评价物质的抗氧化活性。 利用这一方法进行的研究证明，不同疾病患者血浆和血清的抗氧化活性是不同的。

6、 H 2 O 2 激发的化学发光

（1） 血浆和血清的化学发光

在血浆和血清中加入 H 2 O 2 溶液后能激发化学发光。有报告提出，发光强度与血浆中血红素的水平呈线性相关，相关系数为 0. 71 。在上述发光系统中，加入过氧化氢酶或松香油后，发光被抑制，加入叠氮化钠 (NaN 3 ) 后，发光几乎完全消失。 H 2 O 2 激发的血浆和血清的化学发光，其启动因素很可能是血红素过氧化物酶催化 H 2 O 2 分解引起的。血红素过氧化物对 H 2 O 2 的分解是以 H 2 O 2 氧化其底物为前提的。

在这一反应过程中导致自由基及其中间产物生成，并与机体分子相互作用，产生 O2 等活性物质，产生发光。 NaN 3 和松香油是 O2 的抑制剂，所以在上述发光系统中加入松香油的 NaN 3 后，发光被抑制。血液中血红素过氧化物酶等以自由基方式分解 H 2 O 2 ，而过氧化氢酸则以非自由基方式分解 H 2 O 2 ，生物体内这两类反应体系协同作用，能很好的清除细胞内的 H 2 O 2 。病理条件下，这一反应体系的平衡被破坏， H 2 O 2 激发的化学发光强度将发生相应改变。因此，根据血浆和血清化学发光的变化，有可能对某些疾病进行区别诊断。

（2） 红细胞的化学发光

1981 年 Cepгиеко 等人在分离出的红细胞悬液中加入 H 2 O 2 溶液，对其化学发光进行测量。 发现，随着红细胞的老化和溶解，系统发光强度呈增长趋势。随后对实验性动脉粥样硬化家兔红细胞化学发光进行的测量发现，与正常对照组相比，发光强度出现了降低。这可能是由于细胞膜中胆固纯含量过高造成的。对恶性肿瘤患者的调查也发现发光强度的改变。红细胞的衰老与脂质过氧化有关。 H 2 O 2 能引发膜脂过氧化， H 2 O 2 和脂质过氧化产物都能引起血红蛋白释放 Fe 2 ， Fe 2 是诱发一系列自由基反应、起动脂质过氧化的催化剂。自由基的产生不仅促进了红细胞的衰老和溶解，而且引发的脂质过氧化还可以导致膜脂组分和结构的改变，直接影响红细胞的生理功能。