CCK8 新手村：实验心得整理

摸条件包括：

1、种板数；

2、种板后细胞的贴壁生长时间；

3、加药后的孵育时间；

4、cck8试剂加入量；

5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。

看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

补充：谢谢大家的热烈讨论。突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题，园子里也有前辈提过。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊

补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？

再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。

@呆呆的初行者：前辈好。我也有考虑过测之前换液，不过说明书上说酚红对检测不影响，就偷懒没有换。不过想请问换液是直接用吸管将废液吸走吗，要吸很干净吗？

@梧桐如雪：不好意思，已经回你消息啦。枪头吸会更干净些哦！操作熟练后基本可以控制每次的实验误差在10%或20%之内。检测之前最好镜检，要相信自己看到的，而不是一味遵从比色数据。我就是因为每次镜检，才会发现很多显色液使用过程中的问题，再加以改进，直到理论数据与实际看到的相符。不要怀疑自己的能力，有时候只是细节方面没有做好罢了，我们一味照本宣科了，太迷信产品说明，没有做足预实验。

说下最近遇到的问题，也许会对一些人有些帮助。测活用的细胞株的药物敏感度是最重要但是也是很容易被忽视的问题。如果你不是用原代的话，商品化的细胞株有个很致命的问题就是细胞代次。测活用的细胞不能有所变异或者功能退化，这很致命，但这是不停的传代必然导致的问题。我一直坚持认为要用从ATCC购买的细胞，在小代数以内尽可能冻存尽量多的细胞。这回贪便宜在某院细胞所买了一株未知代数的细胞株（再具体就不说了，大家心里明白啊，呵呵），我花了大半年时间几乎没有任何实验结果，最后用干扰素一测，该细胞压根儿没有反应……崩溃了！挨了很多批评不说，自己的信心差点丢失了。现在又要花两个月的时间去买ＡＴＣＣ的细胞，真的很得不偿失的。说下ＡＴＣＣ的细胞价格，官网价格乘以１８，就是人民币的价格，代理商么大陆就一个，我就不作宣传了，大家可以自己去查。最好走正规代理商，运输历时近两个月，小代万一出问题了，赔偿问题很纠结的。如果你的产品最后需要申报，细胞来源也需要证明，当然走正规渠道比较放心些。

@barin：非常感谢楼主的提示。此次实验基本认为要失望了。总结做过的2次CCK-8实验经验，更准确的话说是失败经验如下：

1）CCK-8加法：沿侧壁加入，避免产生气泡。还有一个技巧是用1：1体积的培养基混匀后加入，这样起到减小加样误差。

2）CCK-8使用之前，先做个标准曲线。用不同的细胞数接种，然后加入CCK-8 1小时，2小时，3小时检测450nm 以OD值1.0--2.0为标准选择细胞数。

3）确认药物跟CCK-8不反应。在培养基中加入CCK-8，2-3小时后检测。以及在培养基中加入药物和CCK-8，2-3小时后检测。检测出来的OD值为空白对照，以不超过0.3为标准。

本文来自丁香园论坛

作者@呆呆的初行者