高效液相色谱之高效排阻液相色谱
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和经典常压色谱相比它有以下特点：
1、HPLC分离、纯化蛋白质的速度快。通常半小时左右可进行一次，大大缩短了纯化蛋白质的时间；
2、分辩率高。一根长10cm的色谱柱可分离十几种以上的物质；
3、适应面广，灵活性强，几乎所有的蛋白质根据它们的性质差别（等电点、疏水性、分子量、电荷分布等）都可以用不同HPLC方法进行分离提纯；
4、灵敏度高。HPLC现已广泛采用多种高灵敏度的检测器，如紫外、荧光、电导等。荧光的灵敏度可达10-9g；
5、重复性好，在作分析蛋白质分析试验时，误差一般不超过5%。
因此，HPLC在蛋白质分离纯化方面具有极其重要的位置。一般高效液相色谱仪主要有以下部分组成：
1、输液泵，为色谱柱输送液体；
2、进样器；
3、色谱柱，对样品进行分离；
4、检测器，对分离后样品进行检测；
5、记录器（数据处理和打印部分），对检测到的信号进行处理和记录；
6、程序控制器，对各部分进行程序控制，例如输入色谱条件、参数等。另外，常配有贮液装置、脱气装置、分部收集器等。根据分离模式的不同，高效液相色谱通常分为以下几种模式：
1、高效排阻液相色谱，按蛋白、多肽分子量大小进行分离；
2、高效离子交换液相色谱，按蛋白质、多肽带电不同而进行分离；
3、高效反相液相色谱，按蛋白质、多肽的疏水性不同而进行分离；
4、高效疏水作用液相色谱，其原理与反相色谱相同。区别在于疏水色谱的填料表面疏水性没有反相介质的强
5、高效亲合液相色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选择性分离的一种生物大分子分离方法。又叫体积排阻色谱（Size exclusion chromatography, SEC），分子筛色谱（molecular sieve chromatography），凝胶过滤（gel filtration）等，生化界常用凝胶过滤。SEC是一种纯粹按照溶质分子在流动相溶剂中的体积大小分离的色谱法，填料具有一定范围的孔尺寸，大分子进不去而先流出色谱柱，小分子后流出。用于生物大分子分离的传统SEC填料主要是多糖聚合物软胶，只能在低压下作慢速分离用。目前在很大程度上被微粒型交联的亲水凝胶（如交联琼脂糖Superose6和12），乙烯共聚物（如TSK-Gel PW）和亲水性键合硅胶（如Zorbax GF 250和450）所取代。
随所用填料的孔径大小不同，SEC能分离的分子量级分范围在1万到200万之间。对于分析分离或实验室小规模制备，平均粒度在3-13微米的规格较适用，有良好的柱效率和分离能力。但对大规模的制备分离和纯化，因要考虑成本和渗透性，可以采用较粗的粒度。HPSEC的负载量较低，分析型HPSEC负载量在10-500μg之间，体积负载为柱总体积的1-2%。
（一）实验目的
检测nrhTNF（四）样品准备
