垂直电泳槽的使用

实验材料

•BSA（1 mg/ml），0.05 g的BSA(Sigma-Aldrich Ltd.)溶于50ml ddH2O中，每Eppendorf管约加入1ml溶液，并在-20℃下冷冻。

•预染色marker (Bio-Rad)

•ProMarker(Wealtec)

•两套玻璃板与校正卡，厚玻璃板与U形玻璃板，0.75 mm厚胶条和一个0.75 mm 10齿梳（Wealtec）

•浓度为12％的SDS-PAGE分离胶（0.75 mm）;2.31 ml ddH2O，2.8 ml浓度为30％的Acrylamide/Bis（29:1）(Bio-Rad)，1.75 ml的1.5M Tris-CL，pH 8.8(Sigma-Aldrich Ltd.)，70 μl浓度为10％的SDS(Bio-Rad)，70 μl 10 ％APS(Bio-Rad)，2.8μl TEMED(Bio-Rad)

•5％SDS-PAGE浓缩胶（0.75 mm）; 1.7 ml ddH 2 O，0.415 ml 浓度为30％的Acrylamide/Bis（29:1）（Bio-Rad），0.315 ml的1M Tris-CL，pH值为6.8（Sigma），25 μl浓度为10％的SDS（Bio-Rad），25 μl浓度为10 ％的APS（Bio-Rad），2.5 μl的TEMED（Bio-Rad）

•10X Tris-Glycine缓冲液（Sigma）

•V-GES灌胶模具（Wealtec）

•V-GES电极与电泳槽（Wealtec）

•制冷恒温金属浴（Wealtec）

•恒温金属浴（Wealtec）

•胶铲（Wealtec）

•考马斯蓝染色缓冲液（浓度为0.1％的考马斯亮蓝 R-250（Bio-Rad）溶于水/甲醇/乙酸（比例: 45:45:10）混合液中）

•脱色缓冲液（水/甲醇/乙酸（比例:45:45:10））

•配有紫外/白光转换板的Dolphin Doc凝胶成像系统（Wealtec)

步骤

灌胶并将胶块置入电极中：

•灌胶之前，用75％的乙醇擦试玻璃板和胶条。向上抬起翼型扳手打开灌胶模具，并将模块水平放置到台面。将玻璃板和胶条按顺序放入V-GES灌胶模具中（图 2）。

•记得将校正卡恰当地插入厚玻璃板与U形玻璃板之间的空隙，以确保胶条插入位置准确。合拢灌胶模具后并直立放置，双手均匀用力向下扣住翼型扳手以关闭灌胶模具。若位置正确，校准卡应该可以正常上下抽拉活动而不被夹在胶条与玻璃板之间。（图3- 5）

•用5 ml分离胶溶液（图 6）制备浓度为12％的SDS-PAGE凝胶，然后用移液管将1 ml乙醇滴入装好的灌胶模具中。等候60分钟使凝胶聚合。当把溶液倒入玻璃板夹层之间时，将移液管嘴直接置于玻璃板之间，缓慢地滴出液体，尽量避免形成气泡。凝胶完成聚合后，移除乙醇，将制备好的浓缩胶溶液倒入到分离胶上。轻轻将0.75 mm 10孔梳子插入玻璃板之间。确保无气泡产生（图 7）。让浓缩胶聚合60分钟。

•在900 ml蒸馏水中稀释100 ml 10 X缓冲液，并添加SDS, 制成最后浓度为3.5mM的 SDS-PAGE电泳缓冲液。

•将两个翼型扳手均匀施力掰开，从灌胶模具中取出凝胶三明治夹。通过灌胶模具背后留的两个大孔，轻轻向上将三明治夹推出（图 8）。

•将电极放入垂直电泳槽内。贴着电极壁，将凝胶三明治夹垂直方向插入电极中（图 9）。

•把凝胶三明治夹置于合适的位置后，关闭电极门（图10）。

•如只运行一块凝胶，则需要把胶门（很厚的玻璃板）插入到电极空着的一边。将SDS-PAGE电泳缓冲液倒入凝胶三明治夹与胶门之间，直到缓冲液表面距离玻璃板上缘1cm（图 11）。检查是否有渗漏。将1升的SDS-PAGE电泳缓冲液倒入槽内凝胶组件的周围。

样品制备和装载：

•将试管插入至制冷恒温金属浴（4℃），以解冻冷冻牛血清白蛋白（BSA）（1 mg/ml）样品。 然后，加入25μl 4X蛋白染料及75 μl的已解冻牛血清白蛋白溶液。

•把样品加样到凝胶中前, 请在恒温金属浴中以95℃的温度煮沸混合好的 BSA样品、预染标记和 ProMarker，5分钟。

•向凝胶中装载样品前，用100μl的移液器轻轻抽放缓冲液冲洗井孔让样品孔更平滑。在把样品放入凝胶前，做简单离心与混匀保证蛋白溶液浓度不变。在每个孔中注入10μl的蛋白质样品（图 12）。

•将安全盖安装到槽顶部，并将电极导线连接至电源（图 13）。

•开始电泳：90 V运行60分钟，130V再运行60分钟。

•电泳后，将胶铲插入到两玻璃板之间，轻轻来回撬动直到两板分开，把凝胶从玻璃板上移除（图 14）。 除去上层胶，用考马斯亮蓝溶液染色下层分离胶15分钟。

•将凝胶置于脱色缓冲液过夜震荡进行脱色。

•通过Dolphin-Doc凝胶成像分析系统的紫外/白光转换板拍照。

结果

图1. 电泳后的凝胶。左边外侧孔装载预染色marker，右边两个外侧泳道装载Pro-marker。中间的孔装载1 mg/ml的牛血清白蛋白 (BSA)。浓缩胶部分已被除去。

备注

•在12％的分离胶中用恒定电压输出设置对样品进行分离, BSA（66.2 kDa）被精确地分离到相对于预染色Marker（Bio-Rad）在凝胶中的迁移的位置。

•在制作下层分离胶的同时，将溶液注入玻璃板后, 请使用EtOH溶液或蒸馏水将凝胶处理平整。否则，外道的蛋白质会倾向于向一侧偏斜。

•分离小体积、或者极端大小体积的蛋白质/多肽时，可能需要使用不同凝胶浓度、分离时间和电压设置。除了向蛋白质样品添加诸如荧光蛋白染色剂等添加剂外，混合物也可能改变蛋白质的迁移特性。

•实验者在组装玻璃板和胶条的过程中务必格外小心。若胶条放置不当，可能导致漏胶。使用校准卡可以更方便地找到胶条的正确位置。

•组装好灌胶模具之后，可在倒入制胶溶液之前, 用移液管往玻璃板夹层注水, 并等待约5分钟，以测试是否有渗漏。