WEALTEC垂直电泳仪的使用方法
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本实验的目的是学习WEALTEC垂直电泳仪 基本操作流程,确保垂直电泳仪正常运行。主要内容如下:灌胶、染色与脱色注意事项,详细方法如下:
一、 灌胶
1. 把制胶器放在平稳的台面上。
2. 保持制胶器干燥,抬起两侧的羽状开关放开卡门,平放,放进橡胶垫圈并紧扣。先把厚玻璃平板放入,再放两侧的垫片,后放入带凹型的玻璃平板。
3. 紧紧合上卡门,同时按压两侧的羽状开关听到“咔嚓”声音。
4. 倒分离胶:将配好的分离胶溶液用加样枪缓慢加入制胶玻板之间,直至液面达到卡门边框下缘线处。小心用加样枪将去离子水 沿水平方向加入制胶板中的分离胶液面上,以防止胶液蒸发并保证胶面平整。聚合大约需要30mins。
5. 倒浓缩胶:分离胶聚合后,倒掉去离子水,用滤纸吸去残液。在玻板中加满浓缩胶溶液,轻轻地插入合适的梳子,梳子的厚面向实验者,避免产生气泡。
30分钟后,除去梳子,抬起两侧的羽状开关放开卡门,拿出带胶的制胶玻板。
6. 安装电泳槽 :按压电泳槽中央夹具的开关使卡门松开,将玻璃夹板放入槽内。注意,两玻璃夹板的凹玻板均应与电泳槽内芯接触。如果每次只电泳一块胶,另一套玻璃夹板必须用提供的有机玻璃板代替。
7. 样品处理:在等待浓缩胶聚合时,可对样品进行处理,在样品中按1:1体积比加入上样buffer,在100℃加热3-5分钟以使蛋白质变性。
8. 加样:在外水槽加电泳缓冲液至槽体的一半位置。放正槽体,继续加注缓冲液,避免产生气泡,使内槽的水位均超过凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加样器或普通加样枪在梳井内按预定顺序加样,加样量通常为10~25μl。
9. 电泳:盖好上盖,在100—150V的电压下电1—2小时,一般浓缩胶电压80V20~30Min,分离胶120V80Min,到样品指示剂到达玻璃板的下缘,关掉电源。取下玻璃夹板。用刀片或薄板将胶板玻璃橇开,用单面剃刀片将分离胶切掉,将凝胶板的左上角切掉一小角以标记样品顺序。
附录
染色与脱色(考马斯亮蓝法)
1. 如上所述,将电泳好的凝胶板取出。手戴橡胶手套将凝胶小心移入染色器皿中。
2. 在染色皿中加入100ml考马斯亮蓝染液(含0﹒25﹪考马氏亮蓝R-250,45﹪甲醇,10﹪冰醋酸的水溶液),加盖,在摇床上染色2小时。
3. 将染液倒回贮存瓶,反复使用。在染色皿中加入100ml脱色液(10﹪冰醋酸,45﹪甲醇),振荡脱色3小时,也可反复更换脱色液,缩短时间。
胶的保存
用30﹪甲醇,7﹪乙酸,2-5﹪甘油混合液振荡处理1小时。
注意
1. 清洗玻璃板。玻璃板应清洗干净,玻璃表面的油污会造成分离胶与浓缩胶界面的不平整。经用去污剂洗涤后的玻璃板先用蒸馏水冲洗,再用纱布蘸乙醇擦拭玻璃表面。
2. 分离胶浓度的选择。低浓度胶对大分子量蛋白质分离效果好:高浓度胶对小分子量蛋白质分离效果好。
3. TEMED的加入量。TEMED是促进丙烯酰胺聚合的加速剂。加速效果随试剂保存时间而变化。对于陈旧试剂,可适当多加。事实上,配制分离胶时每块胶板按2滴加入,效果也不错。
4. 电极缓冲液的配制。电极缓冲液的用量大、占体积、配制麻烦。如果经常跑胶,可考虑配制5X浓度的浓缩液。方法如下:将144g甘氨酸和30﹒2gTris溶于1升蒸馏水中。使用时稀释5倍。
5. 丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用。但在形成凝胶后则无毒。操作时应戴橡胶或塑料手套,尽量避免接触皮肤,并注意实验后洗手。
电转印:
正极(在下方,红色电极) 两层滤纸 NC膜或PVDF膜 PAGE
胶 两层滤纸 负极(在上方,黑色电极)
定电压:10V, 40~60Min
注意:NC膜要放在正极,要用手或滚子压走气泡。
转印完毕,将NC膜取出,室温干燥30-60min,浸入1%BSA的PBS液中4℃过夜封闭。
2) 酶免疫染色
① 取出封闭液中NC膜,含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次。
加入1:400的抗CD59McAb10ml,37℃1h。
② 含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
③ 加入1:4000的羊抗鼠IgG10ml,37℃1h。
④ 含0.05%Tween-20的PBS洗涤5次,1-2min/次
⑤ 加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,显色20-30min。
观察条带情况,判断结果。
电泳槽一般可分为三类即:水平电泳槽,主要是进行核酸分子的琼脂糖凝胶电泳;垂直电泳槽可以在小批量核酸电泳和蛋白电泳中使用;转移电泳槽主要是进行蛋白样品转移的电泳仪。