乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶组织化学染色法

互联网2010-12-02

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乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶组织化学染色法

胆碱酯酶属于特异性酯酶，分为乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)和胆碱酯酶(cholinesterase，ChE)两类。其活性中心是丝氨酸。乙酰胆碱酯酶具有水解乙酰胆碱的作用，广泛分布于神经细胞的粗面内质网、线粒体、核周膜和突触前膜，尤以胆碱能神经元的含量为高，其活性是神经细胞性质和功能的重要参考指标，也是神经系统发育过程中神经细胞分化的一个指标。乙酰胆碱酯酶亦存在于运动终板、肌细胞、红细胞和肝内。胆碱酯酶主要分布于血清、胰腺及唾液腺。乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶两者的化学性质不同，用酶来检测底物特异性时，乙酰胆碱酯酶能最快地促使乙酰胆碱分解，也能分解乙酰基―β―甲基胆碱，但不能分解苯甲酰基胆碱。同时，乙酰胆碱酯酶能被高浓度乙酰胆碱所抑制。但是胆碱酯酶则不同，乙酰胆碱浓度越高，越能被胆碱酯酶所分解。具体反应式如下：

乙酰胆碱+H2 O AChE 胆碱+醋酸酯酰胆碱+H2 O ChE 胆碱十羧酸离子

亚铁氰化铜法：乙酰胆碱酯酶能将乙酰硫胆碱盐水解产生硫胆碱，硫胆碱使铁氰化物还原为亚铁氰化物，后者与铜离子结合成亚铁氰化铜而呈棕色沉淀，以此证明酶活性的存在。若用四异丙基焦磷酰胺ISO-OMPA抑制非特异性胆碱酯酶，则可单独显示乙酰胆碱酯酶。

1)孵育液配制

乙酰硫代胆碱碘盐 5mg

0．1mol/L醋酸缓冲液(pH l 5) 6．5ml

完全溶解后依次加入以下溶液：

0．1mol/L (2．94％)枸橼酸钠 0．5ml

30mol/L (0．75％)硫酸铜 lml

5mol/L (0．164％)铁氰化钾 lml

充分混匀，至溶液呈亮绿色，最终pH 5.5―5.6。临用前30分钟内配制。

2)染色程序：①新鲜组织冰冻切片后用丙酮或10％福尔马林固定20―25分钟或经冷福尔马林钙溶液固定20分钟后冰冻切片；②蒸馏水洗；③人孵育液中，室温2～6小时或37℃ 1～2小时；④蒸馏水洗；⑤乙醇脱水，二甲苯透明；⑥甘油明胶封固。

3)结果：乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶活性部位均显示棕色(红褐色)沉淀。本法孵育液内各成分比例关系很重要，如Cu2+ 浓度太小，易造成弥散假象。pH以5―5．5最好，pH大于6易发生扩散现象。

4)对照实验：在孵育液中加入4mmol/L四异丙基焦磷酰胺(ISO-OMPA)0．2ml抑制非特异性胆碱酯酶而显示乙酰胆碱酯酶(AchE)；用毒扁豆碱硫酸酯3×10-5 mol/L代替蒸馏水，先将切片处理30分钟，水洗后再人孵育液内，两种酶均被抑制而呈阴性。