甲醇酵母系统表达的影响因素

酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。

甲醇酵母可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。这是因为其细胞中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶(AOX)、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中AOX是甲醇酵母利用途径中的第1个酶，它催化甲醇被氧化为甲醛和过氧化氢。过氧化氢进一步由过氧化 氢酶分解成水和氧。甲醛在胞浆内被甲醛脱氢酶(FMD)和甲酸脱氢酶(FMDH)氧化成二氧化碳，或者在5一磷酸木酮糖(Xu5p)、二羟丙酮合成酶(DHAS)催化下形成3一磷酸甘油醛(GAP)和二羟丙酮 (DHAP)。DHAP与GAP在1，6-二磷酸果糖醛缩酶作用下形成1，6-磷酸果(FBP)。FBP又由1，5-二磷酸果糖酶去磷酸化生成Xu5p和GAP。Xu5p又一次参加循环，而GAP有1／3进入主代谢途径，用于合成其他物质。

在甲醇酵母中，已克隆到2个编码高度同源的AOX1、AOX2基因，其中AoX1基因是利用甲醇的第1个酶基因，它的表达是在转录水平调控的。以甲醇为碳源时，生长的细胞中约 5 的mRNA来自AOX1基因。AOX1基因的调控过程分两步：抑制机制加上诱导机制。简言之，在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录；而在以甲醇为唯一生长碳源时，诱导基因转录和蛋白表达。甲醇酵母在含甲醇培养基上的生长速率与野生型类似，称为甲醇利用快型(Mut )，如GS115 (his4)。当AOX1基因被其他基因取代时，则需依赖AOX2基因，AOX2与AOX1有97 的同源性，但甲醇代谢速度慢，称为甲醇利用慢型(Mut )，如KM71。当AOX基因全部缺失，不能利用甲醇时，称甲醇利用负型(Mut-)如MCIO0-3。3型菌株在A0X1基因启动子调控下均可诱导异源蛋白的表达。

甲醇酵母生长的适宜温度一般为28~30℃，诱导期间如果温度超过32℃，则不利于蛋白表达，甚至会导致细胞死亡。以甘油或葡萄糖为碳源时，Mut+和Mut5。的生长速度并无区别；而以甲醇为碳源时，Mut+比 Mut5的生长快。

所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素：

1、外源基因自身的影响

外源基因的特性是决定表达成败的首要因素。外源基因序列中mRNA 5端非编码区(5r-UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。适当长度的5’非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译，5-UTR太长或太短都会造成核糖体40 S亚单位识别的障碍。AOX1基因5r-UTR长为1l4nt，并富含A+U，其编码的乙醇氧化酶表达量极高，故维持外源基因mRNA 5r-UTR尽可能和AoX1 mRNA 5-UTR相似是必需的，最好是保持两者一致。

A+T含量高的基因在甲醇酵母中表达时，有时会造成转录提前终止，共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号。另外在A+T丰富区还存在一些没有确定的转录提前终止信号。因而对A+T含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其(A+T)含量在30％~55％范围内。这种方法使人血清白蛋白(HAS)的表达量提高50倍左右。用这种方法可使破伤风毒素C片段得到高效表达。某些稀有密码子，尤其是稀有密码子密集区往往也成为制约翻译速率的因素，所以应该使稀有密码子突变为酵母所偏爱的密码子来提高表达效率，对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。因此，要得到高效表达，最好对外源基因进行改造，选用甲醇酵母偏好的密码子，尽量使mRNA5’非翻译区的核苷酸序列和长度与醇氧化酶的相似。