免疫组织化学图像处理预热篇——图像分析原理及过程 懂原理更精通

图像分析基本原理及分析过程

概述

在生物及医学研究中，对图像的判读与分析特别是对显微镜下微观图像的观察研究从来都是重要的研究手段。随着技术的进步，分析图像的方法也从眼观尺量进入到了使用计算机软件进行定量分析的阶段。计算机软件的发展速度呈加速前进，采集图像的设备也不断更新，这使得我们能有更多的手段来分析测量复杂的生物图像。

现在我们可以使用CCD数码相机来采集图像。使用功能比较强大的图像分析软件来进行图像分析测量。相比之下，在不太久远的十来年前使用的图像分析仪及单色的图像采集摄像机已经过时了。而图像分析的手段也比以前丰富。简单地引用以前的分析方法未必就是最佳的方法，在许多情况下，需要我们依据软件及相机的情况设计与研究目标相适应的分析方法。

分析测量图像绝不仅仅是一个软件使用的问题，而是从实验设计开始，就要综合考虑研究目标、样品制作方法、拍摄方式、选择视野等各方面因素，最后才是通过软件实现最有效的图像分析测量。一个完整的图像分析过程应该包括：

1.明确需要测量分析的对象。

2.使用适当的方法拍摄下这个对象

包括进行适当的染色及取样，采集到突出显示的测量对象的照片。

3.分析照片上的图像元素,

确定能反映测量对象的图像图形4.测量照片上的图形的测量参数,进而得到测量对象的测量数据5.对测量对象进行统计分析。图像分析的最佳效果，是利用图像分析软件可以自动地判断测量目标，准确分析测量出目标对象的数值。由于生物图像的复杂性，软件往往作不到这一点。此时只能退而求其次，采取抽样统计，手工选择等方法进行近似的测量。测量方法本身有时候也能成为一个研究课题。

一、把研究目标转换到图像分析问题上

常用的分析测量，是已经有比较成熟的方法的，以免疫组化样品为例：

免疫组化的分析对象（分析测量的目标）是组织切片上特定蛋白的表达量。为了达到这个测量目标，先用特定抗体与切片反应，使之与切片上的特定蛋白结合，然后用DAB对结合了蛋白的抗体进行染色。这样，DAB的染色深浅及范围就能反应切片上相应蛋白的表达量了。所以免疫组化技术就是把切片上“蛋白表达量”这个研究目标转换成了切片上“黄色染色物的分布”这个图像分析问题。

荧光标记的免疫组化图片与此类似。

另一个例子：

利用凝胶电泳方法来测量RT-PCR产物的分子量及质量（重量），研究目标是样品中各种DNA片段的分子量与质量。通过电泳把加样孔中的样品分布到泳道之中后，不同分子量的产物成份会分布到泳道的不同位置，形成条带。用EB染色后，在紫外灯照射下各条带发出荧光，就能显示出条带的位置与强度信息。这样就把研究目标（产物的各组分分子量与该组分的量重）转换成了凝胶图像上的条带的位置与光密度这个图像分析问题。

具体到前面提到的那些没法回答的问题，实际上就是提问的信息不够，没法确定如何把研究目标转换为图像分析问题。当然，这类分析方法往往是从文献上查找到的，是已经有的分析方法，这时候就要仔细学习参考文献上相关的叙述，弄明白文献上的方法是把分析目标转换成什么样的图像分析目标。明确了这一点后，才能考虑如何通过图像分析软件实现正确的测量。甚至进一步改进测量方法。

二、正确地处理样品并进行拍摄

处理样品主要是指对切片作正确的染色。虽然染色的方法基本上有一个规范的程序，但进行图像分析的时候，根据分析目标对染色方法作适当的优化能让分析测量更加方便准确。

在免疫组化切片染色时，由于要分析比较染色深浅，所以在制片时就要强调以同样条件制作所有的组织切片。曾经遇到一位，在染色时，遇到阴性样品就有意延长一下显色时间，让片子黄一点，结果是阴性结果的光密度测量数值与阳性样品一样大。

如果要分析细胞核，就得特别注意苏木青蓝染的深浅要适当，一般情况下，浅浅的蓝色只能标记出细胞核的位置，明显的蓝色才适合于进行细胞核尺寸的测量或对细胞进行计数。而在进行细胞核上蛋白的免疫组化分析时，过浅的蓝染会导致细胞核选择困难，过深的蓝染则会掩盖免疫组化产物的颜色。

关于荧光免疫组化的染色就更复杂了，单染色的样品要注意样品荧光与背景荧光的对比度要足够高。双染色的样品还要注意两种染料的荧光强度应当适配，不要一种颜色的荧光特别强，另一种特别弱。最常见的是红色荧光特别亮，而FITC的绿色却很弱。结果是在拍摄时绿色的荧光实际上是红色荧光图像的绿色分量。

拍摄样品时影响的因素更多，更容易出错。

在拍摄大体物品时要特别注意背景与物体之间的对比。在拍摄离体组织器官时，把组织块放在干净的白纸或黑纸上以保证组织图像与背景之间有清晰的分界线，在两侧各用灯光照明以避免留下影子。在缺乏照明条件的时候，也可以选择在室外背光处拍摄，既有足够的照明也能避免明显的阴影。

一般的组织切片只要正确选择视野并拍摄清楚就行了。而免疫组化的样品却额外要注意拍摄时的曝光：以同样的曝光条件拍摄样品。特别是荧光，一个对照组的弱荧光样品，就应该拍摄得光强较弱，阴性的甚至拍摄出一张黑照片。如果有意延长弱样品的曝光，照片虽然漂亮，但其表现的光密度就与阳性样的强荧光差不多了。所以在我介绍免疫组化样品的分析方法之前，都是先强调如何拍摄样品。

在使用倒置显微镜拍摄活细胞的时候，很多人并未注意到在显微镜上方的灯光筒下边有一个长方形可推移的板，上面有三四个大小不一的园孔，这几个孔的位置是与物镜的选择有关的。高倍镜要使用小孔，低倍镜用大点的孔。选择不对的时候，观察图像的反差不好。

拍摄彩色照片的时候，相机色彩也是常被忽视的。最常见的是拍摄的照片色彩偏蓝。这对分析免疫组化图片的影响非常大。偏蓝的照片不仅降低了黄色深色的深浅程度，而且会使较浅的黄色变成了白色甚至浅蓝色。

三、确定图片上的测量目标

在分析图片时，虽然我们嘴上说的是测量细胞、细胞核或胞浆。但是心里应该有一个概念，就是实际上我们测量的是图片上的一片黄色，一个蓝色的园斑，或者一些边界线围成的区域，或者是某种色彩组成的区域。有了这个概念，才能真正地把研究目标转换到图像分析的目标。进而进行正确的测量。

生物图像几乎没有直线、正方或圆形这样规则的图形。因此，要测量对象的长度，面积，直径这些指标时，是需要考虑该如何进行近似测量或等效测量的。软件可以准确测量不规则曲线的长度与不规则区域的面积。其他的指标往往就需要作等效计算或近似计算。

例如：测量细胞的半径。可以先测量细胞的面积，然后利用area=pi *r^2公式计算其等效半径。也可以通过细胞中心画一组放射线，测量细胞在这些放射线方向上的直径，然后取平均值作为它的近似测量值。这种测量等效值或近似值的方法在几何测量中经常用。我个人认为测量等效值更准确一些。

选择测量目标的另一个原则是要保证测量的可重复性。即使是手工测量，也应当保证两次独立的重复测量数值不会有太大的差异。

四、使用软件测量

说到这里，才算是提到了图像分析软件了。

实际上Image-pro plus不过是许多种图像分析软件中的一种。它是一种通用的图像分析软件，不仅是用在生物图像分析上，在其他场合用得更多。其优势当然是功能强大，操作也顺手。缺点只有一个，就是贵。请大家不要在此场合讨论非正版软件的问题，这不符合丁香园网站的规定。

通用的软件适合于多种场合下的应用，专用的软件则有特定的应用场合，比如凝胶电泳分析软件，它的功能范围远比不上通用的图像分析软件，但是在分析凝胶电泳图片时，它却非常方便。这次既然提到了关于RT-PCR凝胶图片的分析及Western blot膜的分析，就得提到Image-pro plus的姊妹软件：gel-pro。如果使用IPP来分析电泳图片，恐怕会相当麻烦而且结果会比较粗糙。用gel-pro来分析就轻松得多了。

Image J也是图像分析软件。与IPP的功能类似，操作当然有不同。优点是能自己编制处理功能，但要作到这一点却是有难度的。

专门分析凝胶图片的软件是很多的。常用的除了gel-pro之外，还有bandscan，quantity one, visionworks等，它们大多是与凝胶拍摄系统一起购买使用的。分析原理都一样，操作上略有不同，功能基本上都差不多，用哪个都行的。用惯了IPP，再用gel-pro会熟悉一些。

使用凝胶电泳分析软件可以分析DNA凝胶图片，RNA凝胶图片，蛋白质的凝胶电泳图片，Western blot膜的照片，化学发光作的Western blot胶片等。

具体的软件操作步骤不是本讲座的重点。在另外文章里，有关于Image pro plus以及 gel-pro软件的详细具体的操作方法。

五．测量数据的统计分析

实际上统计分析测量数据依然是把研究目的转换成图像分析的问题的一部分。虽然是最后进行的工作，但在一开始就需要考虑对测量数据该如何处理。

在最理想的情况下，使用软件能准确地识别图像上的测量对象，识别准确了，测量也就准确了。

生物图像本身是相当复杂的。软件不能识别测量对象的情况非常普遍。往往只能手工选择测量对象，这当然会有误差。在更多的情况下，测量对象有许多，手工无法全部选择上，这时候还得更退一步，选择部分对象进行抽样测量，这就必须要统计分析。

实际上，在分析组织切片的时候，拍摄照片本身就是一种抽样。你不可能把切片全部拍摄下来，而是选择几个视野拍摄下照片。在哪里拍摄就有讲究了。再深一步探究，就连在组织块的哪个部位作切片也是一种抽样。这是图像分析软件所无能为力的。所以从根本上来说，如何进行测量数据的统计分析并不是图像分析的问题，而是实验设计的问题。与图像分析有关的是，实验设计时必须考虑到图像分析的因素。才能实现最终的实验目标。

有句俗话叫“功夫在诗外”。要想写出好诗，关键并不在于写诗的技巧有多高，而在于诗人的境界有多高。类似的，要想应用好图像分析软件，关键并不在于对软件的操作技术有多熟悉，更重要的却在于实验设计上。在设计实验的过程中就要考虑如何利用图像分析来得到有意义的实验结果。有的时候，通过图像分析能得到眼睛看不出来的有意义的实验结果。