你不得不知道的 ImageJ 图像处理工具——Plot Profile
丁香园
ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/）是一个基于 java 的公共的图像处理软件，它是由 National Institutes of Health（NIH）开发的一款功能强大的免费软件，在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。
下图是 ImageJ 官网的界面。在 Download 下根据自己系统选择对应的软件下载，ImageJ 可以适用于 Mac OS X，Linux 以及 Windows 系统（不受电脑系统及版权限制）。
今天来给大家介绍 ImageJ 中 Analyze 菜单下的一个实用工具——Plot Profile。Plot Profile 可以实现以下 4 类操作，接下来将一一讲解。
定性表达共定位
三维图像的共定位
测量长度
矩形范围内荧光强度变化
定性表达共定位
上图是 Journal of Cell Biology 发表的文献中，使用 Plot Profile 工具来表示 X103 与 NDH II 存在部分共定位。
不同荧光在同一空间分布，例如两个蛋白都定位在核内或胞浆，可以通过 Plot Profile 工具得到的随着划线 distance 的荧光的灰度值来实现。
具体步骤如下：
Step 1：
打开 ImageJ 软件 >> File >> Open打开待分析图片（RGB格式）：
使用划线工具，划线如下：
点击 Analyze，Plot Profile（快捷键 Ctrl+K），得到如下结果：
Step 2：
如何得到 RGB 三个不同荧光通道的 GrayValue 呢？
首先点击 Image >> Color >> Split Channels，得到 Red，Green，Blue 三通道的图片：
Image >> Color >> Merge Channels:
点击 OK，此时可以看见图片左上角有三个通道，c：1/3 红色，c：2/3 绿色，c：3/3 蓝色，左下角有 C 通道，可以根据鼠标滚轮选择：
此时再使用使用划线工具，重复 Step1 中步骤，此时通道为蓝色通道：
点击 list 导出数据：
将通道换到绿色通道，点击 Live 得到绿色通道荧光分布，点击 list，导出数据。
最后以同样的方法得到红色通道数据：
将导出数据导入 Excel 表格或者 Origin 进行绘图即可，打开 Origin，输入数据，如下：
Step 3：
如何直接一次性获取RGB格式图像的各通道荧光分布呢？
首先打开RGB格式图形，划线，如下图：
点击 Analyze，Tools，Color profile，得到如下结果，List 导出数据即可。
如何表示三维图像共定位？
下图是 2017 年发表在 Circulation Research 上的一篇文章中的图。
红色 DiO 是用亲脂性染料标记的血管，绿色是吞噬了 Dextran 的血管周巨噬细胞，蓝色是颈动脉注入的荧光标记的 Aβ1-40。作者通过 XY、YZ、XZ 三个面显来表示共聚焦拍摄三维图片中三者共定位（图中虚线交叉点）。
（DOI:10.1161/CIRCRESAHA.117.311054）
如何使用 Imagej 软件实现，且听我一一道来。
Step 1：
打开 Imagej 软件 >> File >> Open，打开一张蔡司共聚焦拍摄的层扫了 Z 轴的图片：
我们可以看到这张图片有三个通道，分别为 R、G、B 每个通道层扫了 5 层，滑动滚轮可以展示不同通道，拖动 Z 可以观察不同层面。
点击 Image >> Clolor >> Split Channels，可以看见 R、G、B 三个通道的图片：
Step 2：
点击 Image >> Color >> Merge Channels >> 点击 OK
可以看见 Merge 以后的图片，滑动滚轮可以展示不同通道，拖动 Z 可以观察不同层面。
Step 3：
点击 Image >> Stacks >> Orthogonal views，就可以看见和文献中相同的正交视图，即显示 XY, XZ, YZ 视图，XY 视图中的黄色十字可以用鼠标拖动。
Step 4：
保存 >> 选择 YZ 视图 >> 点击 File >> Save as >> 保存为 tiff 格式：
同样方法保存 XZ 视图。
对于 XY 视图，点击 Image >> Color >> Stack to RGB
此时图片变为 RGB 格式：
点击 Image >> Stacks >> Z project，对 Z 轴 5 张图片进行最大密度投影：
File >> Save as >> 保存为 tiff 格式。
打开 PS 软件，导入刚刚保存的 XY, XZ, YZ 的图片，进行美化即可。
测量长度
如何实现测量这些空隙时间（红色圈内）的长度？手动划线测量确定起点和终点很容易有误差，Plot Profile 就能很好进行此类问题的长度测量。
打开 ImageJ, 打开图片，使用划线工具，按住 shift 划直线如下：
点击 Analyze，Plot Profile（快捷键 Ctrl+K），得到如下结果：
黄色线所示的长度即为空隙时间（红色圈内）的长度：
此时得到的为 Distance，如何转换为原图对应的时间？
在原图上，使用划线工具，按住 shift 划直线如下：
此时的时间长度为 20 min，点击 Analyze >> Set Scale
点击 Click to Remove Scale，Known distance 填入 20，Unit of length 为min，勾上 Global。
此时再进行上述画直线的操作，得到其中间时间间隔为 3 min。
矩形范围内荧光强度变化
Plot Profile 只适用于线和矩形选框，表示线段和矩形选框所经过的范围内的灰度变化（荧光强度），如下图：
下图是 Cell Reports 2015 年发表的一篇文章，作者使用 Plot Profile 工具表示轴突前特定区域（白色箭头）存在 TfR 红色荧光与 AnkG 绿色荧光的急剧变化。
与前述方法一致，先得到不同荧光通道的图片，此时我们只需要将 line 变换为矩形选框，选中白色箭头所指的地方即可。
我们可以发现在白色箭头画一矩形选框，分别对 R 红色通道，G 绿色通道进行 Plot Profile，分别得到矩形范围内荧光强度变化（上面为红色荧光通道，下面为绿色荧光通道）:
参考文献
Nuclear DNA helicase II is recruited to IFN-alpha-activated transcription sites at PML nuclear bodies. Fuchsová B, Novák P, Kafková J, Hozák P - J.Cell Biol. (2002).
BrainPerivascular Macrophages Initiate the Neurovascular Dysfunction of Alzheimer AβPeptides.
Circ Res. 2017Jul 21;121(3):258-269. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.117.311054.
Sorting of Dendritic and Axonal Vesicles at the Pre-axonal Exclusion Zone. Cell Rep. 2015Nov 10;13(6):1221-1232. doi: 10.1016/j.celrep.2015.09.074
