核酸分离与纯化的原则与技术路线

细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白(nucleoprotein)。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein，DNP)，RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。

除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状，单链环状，双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3。0×109个碱基对(base pair，bp)组成，与5243bp的猿猴病毒(simian virus 40，SV40)相比，其长度约为后者的5。7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类，大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。

材料与方法的选择

(一)材料与方法的选择

临床常见的标本有血液，尿液，唾液，组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量，完整性，纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。

(二)选择的原则

核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量，待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则:一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究的最基本的要求；二是尽量排除其它分子的污染，保证核酸样品的纯度，这是本章讨论的主要内容。

(三)核酸完整性的保持

为了保证核酸的完整性，在操作过程中，首先应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。影响核酸完整性的因素很多，包括物理，化学与生物学的因素，其中有些是可以避免的。如过酸或过碱，对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，在核酸的提取过程中，采用适宜的缓冲液，始终控制pH在4～10之间，就可以很好地避免其危害；另外如高温加热，除高温本身对核酸分子中的化学键的破坏作用外，还可能因煮沸带来液体剪切力，因此核酸提取常常在0～4℃的条件下进行。

其次对无法避免的有害因素，应采取多种措施，尽量减轻各种有害因素对核酸的破坏。应尽量简化分离纯化的步骤，缩短提取的时间，减轻各种有害因素对核酸完整性的破坏；DNA酶(DNase或DNAase)的激活需要Mg2+，Ca2+等二价金属离子，若使用EDTA，柠檬酸盐并在低温条件下操作，基本上就可以抑制DNA酶的活性。RNA酶(RNase或RNAase)的广泛存在与不易失活的特点，决定了生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。

技术路线的设计

(一)核酸的释放

正常情况下，无论是DNA还是RNA均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是破碎细胞，释放核酸。细胞的破碎方法非常多，包括机械法与非机械法两大类。机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法。机械剪切作用的主要危害对象是高分子量的线性DNA分子，因此该类方法不适合于染色体DNA的分离与纯化。非机械法可分为干燥法与溶胞法，目前，大多采用溶胞法。其中采用适宜的化学试剂与酶裂解细胞的溶胞法因裂解效率高，方法温和，能保证较高的得率与较好地保持核酸的完整性而得到了广泛的应用。

(二)核酸的分离与纯化

细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子本身可能仍与蛋白质结合在一起。在保证核酸分子完整性的前提下，要从中分离出一定量的，符合纯度要求的核酸分子，并不是一件很容易的事情，这需要我们在对核酸分子有关性质的充分认识的基础上，利用核酸与其它物质在一个或多个性质上的差异而设计有效方案加以分离。这种差异是多方面的，包括细胞定位与组织分布上的差异，物理化学性质上的不同以及各自独特的生物学特性。应该去除的污染物主要包括三个部分:即非核酸的大分子污染物，非需要的核酸分子和在核酸的分离纯化过程中加入的对后继实验与应用有影响的溶液与试剂。非核酸大分子污染物主要包括蛋白质，多糖和脂类物质等；非需要的核酸分子，是指制备DNA时，RNA为污染物，制备RNA时，DNA为污染物，制备某一特定核酸分子时，其它的核酸分子均为污染物；至于在核酸分离纯化过程中加入的有机溶剂和某些金属离子，由于对后继实验有影响，往往需要很好地去除。

(三)核酸质量与提取步骤的关系

一般地，分离纯化步骤越多，核酸的纯度也越高，但得率会逐渐下降，完整性也愈难以保证。相反，通过分离纯化步骤少的实验方案，我们可以得到比较多的完整性较好的核酸分子，但纯度不一定很高。这需要结合核酸的用途而加以选择。

(四)核酸的浓缩，沉淀与洗涤

随着核酸提取试剂的逐步加入，以及去除污染物过程中核酸分子不可避免的丢失，样品中核酸的浓度会逐渐下降，及至影响到后面的实验操作或不能满足后继研究与应用的需要时，需要对核酸进行浓缩。沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其优点在于核酸沉淀后，可以很容易地改变溶解缓冲液和调整核酸溶液至所需浓度；另外，核酸沉淀还能去除部分杂质与某些盐离子，有一定的纯化作用。加入一定浓度的盐类后，用有机溶剂沉淀核酸。其中常用的盐类有醋酸钠，醋酸钾，醋酸铵，氯化钠，氯化钾及氯化镁等，常用的有机溶剂则有乙醇，异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀往往含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除。对于浓度低并且体积较大的核酸样品，可在有机溶剂沉淀前，采用固体的聚乙二醇或丁醇对其进行浓缩处理。