探针制备与非同位素标记新方法

一、概述

近年来核酸杂交技术在分子生物学、临床医学、细胞生物学、分子遗传学等学科领域中应用，得以飞速的发展。基因探针的制备技术及同位素、非同位素标记、检测技术则是基因诊断技术中的关键一环。而从70年代中期以来核酸探针杂交技术就已经在科研和临床中被广泛采用，成为一项直接检查病原体、癌基因和遗传病基因突变的重要手段，而采用的方法主要是用放射性同位素标记的探针来完成。80年代以后人们致力于非同位素标记技术的建立，其中应用最广泛的是生物素标记的核酸探针以及后来发展的以地高辛甙元为标志物，以抗体一酶系统显示的试剂盒。在生物素标记系列中，初期出现的是以Bio-11-dUTP替代TTP在缺口平移中掺入的标记法，随后又改进为随机引物掺入标记法，至1987年澳大利亚推出光敏生物素标记法之后，我们又进一步发展了长臂光敏生物素，使标记方法大为简化，不论双链或单DNA或RNA都可以标记。除临床医学外，应用的领域也越来越广泛。

二、核酸探针的制备

用探针进行基因诊断的关键首先是要取得探针。探针是一段有特定序列的，有一定长度（15个至近千个核苷酸）的核酸片段，也可以是完整基因，亦可以为其一部分；可以是天然序列，亦可以是人工合成序列，但必须加以标记。通过分子杂交来检查标本中的互补序列。

核酸序列可以是克隆的，也可以是合成的，这主要是取决于核酸探针是否能满足特异性要求。如果有特异、或当DNA序列未知而又必须首先进行克隆，以便绘制酶谱和顺序时，常常应用克隆探针。克隆探针一般较寡核苷酸探针的特异性强，复杂性高，较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列的少，并可以获得较强的复杂信号。寡核苷酸探针技术是检测点突变的有效技术。使用该技术的前提条件是必须知道突变的确切位置，只要知道点突变的确切位置，即可人工合成对应于该位置在内的正常和突变的一对寡核苷酸（约20个脱氧核苷酸左右）经末端标记后作为探针。除以上方法外，用PCR扩增产物制备探针，通过电泳分离回收可以得到纯度较好的一定长度的探针。现常用的方法还有直接用提纯的质粒进行探针的标记，这种方法较为方便，获得标记探针较为容易。总之，不论用何种方法得到的探针必须是纯度越纯越好，这样的探针被标记后，才能获得高纯度、高特异性、高灵敏度的标记探针。

三、探针的标记及检测

用于杂交的基因探针必须先进行标记，最常用的是同位素标记和非同位素标记两大类。

使用放射性同位素标记的核酸探针，尤其是在用于常规临床诊断时，存在着有些放射性同位素半衰期较短，易环境污染，操作者个人安全，放射性同位素废物处理等问题。

由于这些限制，非放射性标记探针，在对生物特定核酸序列的定位及定量检测方面，得以迅速发展。

非放射击性标记探针具有令人瞩目的潜力，现以成为热门研究的一个课题（见表2）。

表2 核酸探针的标记