材料与仪器
E.coli 抑制菌株 TG1
脱水四环素 四甲基氯化铵 CSR 油相
TYE 平板 磁力搅拌器
脱水四环素 四甲基氯化铵 CSR 油相
TYE 平板 磁力搅拌器
步骤
下面的实验流程详细描述用 CSR 在 E.coli 中对 Taq 聚合酶突变体的筛选。这个方法保证在标准的 PCR 反应条件下，聚合酶突变体是有活性的。用来产生文库的方法是核苷酸类似物 [27] 和易错 PCR [28]，这里不再描述。引物 1 ( 5'-C A G G A A A C A G C T A T G A C A A A A A T C T A G A T A AC G AG G G C AA-3' ) 针对表达载体 pASK75 [29] 是特异的，用 XbaI 和 SalⅠ将 Taq 基因连接到载体 pASK75。引物 2（5'- G TA A A A CGA CGG CCA GTA CC AC CG AAC TG CG GG TG ACG CC AAGC-3' ) 针对表达载体 PASK75 是特异的。每个引物含有 5' 的突起黏末端，这样可以用引物 3 ( 5'-C AG G AAAC AG C TATG AC-3' ) 和 4 ( 5'-GTA A A A CGA CGG CCA GT-3' ) 来加强 CSR 的筛选。
3.1 用 Tet 启动子在细菌中表达 Taq 聚合酶
( 1 ) 挑取单克隆到 2 ml 的 2X TY [ 见 14.2 ( 2 ) ] 培养基中，并加入 0.1 mg/ml Amp，在 37°C 过夜培养。
( 2 ) 将上述培养液以 1: 100 的比例加入到新鲜的 2X TYA 37°C 培养，直到菌液 OD600 达到 0.6~0.9 ( 培养应不超过 2~3 h)。
( 3 ) 加入 ACROS ( 非毒性四环素衍生物），终浓度为 0.2 μg/ml 到步骤（2 ) 培养液中，诱导 pASK75 种的 Tet 启动子，表达蛋白质。
( 4 ) 在 37°C 持续摇菌 2~4 h。
3.2 收集表达了聚合酶的细胞
( 1 ) 在离心机中 [ 1300 rcf ( 3000 r/min)，15 min ] 离心细胞，去掉上清液，用与培养基相同体积的 1 X Tag 缓冲液轻轻地悬浮细胞。
( 2 ) 重复离心收集细胞和重悬细胞，这次重悬细胞使用 1/10 培养基体积的 1X Taq 缓冲液。
( 3 ) 检测 OD600 的吸收值，确定细胞的个数（OD600 = 1 相当于 8 X 108 个细胞/ml)。
3.3 建立 CSR
( 1 ) 将水相的 CSR 在冰上加入到 1X Tag 缓冲液，加入 1 μmol/L 引物 1 和 2、0.25 mmol/L dNTP、50 μmol/L TMAC ( 可选；见注 1 )、0.05% ( V/V ) 不含脱氧核糖核酸酶的胰腺核糖核酸酶（可选）和诱导表达的细胞（终浓度为 1X109 个细胞/ml)。
( 2 ) 准备油相 CSR，混合轻矿物油、4.5%（V/V）Span 80、0.4% ( V/V ) Tween-80、0.05% ( V/V ) Triton X-100，在室温下持续搅拌。由于表面剂的高黏性，需要准备一个大体积油相 CSR ( 大于 50 ml) ，并且用切断吸管尖去掉表面活性物质。油相的 CSR —旦准备好，可以在黑暗的室温中存放 1 个月。
( 3 ) 将 200 μl 的水相 CSR 加入到 400 μl 油相 CSR，加入过程中要用点滴的方法 ( 每滴 5~10 μl，间隔 5s)，整个过程在 2 ml 的平底管中进行，需要用磁力搅拌器 ( 1000 r/min) 不停地搅拌。
( 4 ) 加入最后 1 滴后，持续搅拌 5 min。最后需要乳化成白色的并且有黏性的状态 ( 见注2 )。
3.4 CSR
( 1 ) 转移乳化液到 0.5 ml 薄壁 PCR 管（100 μl/管），然后加入 2 滴矿物油，防止挥发（见注 3) 。
( 2 ) 进行 PCR 反应，94°C 5 min，裂解细胞，破坏其他酶的活性，然后进行如下 20 个循环：94°C ( 1 min ) ，60°C ( 1 min ) ，72°C ( 5 min)。
PCR 完毕后，乳化相应该仍是白色的，上面覆盖了一层油相。体积可能会减少，但不表明乳化的隔室发生合并。乳化相的聚合或破碎直接表现为白色的乳化相之下有个明显的水相层。这时候就表明有很多因素干扰了乳化相的稳定，如各种成分混合的不充分。
3.5 实施
( 1 ) 用 2 倍体积（200 μl ) 的二乙醚，来分离水相的 CSR。漩涡振荡混合物 20s，然后在 20000 rcf ( 13000 r/min) 离心 2 min。
( 2 ) 出现两个液体层。小心地移动有机相下面的水相层，然后转移到一个新的 1.5 ml EP 管中。
CSR 的反应可以通过两种不同的方法来实施。
3.5.1 PEG 抽提方法
( 1 ) 用苯酸 -氯仿（1/1，V/V ) 来萃取液相层，然后接着用氯仿-异戊醇（24/1，V/V）来萃取。
( 2 ) 在液相层，加入 0.5 个体积的 PEG800/MgCl2 溶液 [ 见 14.2 ( 13 ) ]，然后用吸量管上下反复混匀几次。
( 3 ) 室温，20000 rcf (13000 r/min) 离心 10 min。去掉上清液（含有剩余的引物和 dNTP），沉淀用 TE 重悬[ 见 14.2(14)]。
( 4 ) 遗留的聚合酶，在加入 20~50 U DpnI 到液相层中，37°C 放置 1 h 后，其量可减少（见注 4)。
( 5 ) 为了确保完全去除引物，进一步利用 PCR 纯化试剂盒（Qiagen) ，纯化液相层中的 CSR 产物。用 35% ( V/V ) 盐酸胍洗 2 次，保证完全去除残留的引物。最后将纯化的产物加到 50 μl 的缓冲液 EB 中 [ Qiagen；见 14.2 (16)]。
3.5.2 快速实施
( 1 ) 利用 14.3.5.1 步骤（5 ) 中的方法，用 PCR 纯化试剂盒纯化 CSR 产物。用 35% ( V/V ) 盐酸胍洗 2 次，保证完全去除残留引物。最后将纯化的产物加到 50 μl 的缓冲液 EB 中。
( 2 ) 取 7 μl 的产物，加入 1 μl 的 10 X Taq 缓冲液、1 μl 的 20 U/μl DpnI 以及 1 μl ExoSAP，然后在 37°C 放置 1 h，接着在 85°C 放置 15 min。
3.6 提取
( 1 ) 使用外侧巢式引物 3 和 4，2 次扩增需要筛选的基因。20% 的需要筛选的产物被加入 50 μl 的 PCR 反应液中（即 10 μl 的纯化产物加入到 50 μl 溶液中）。但是，这个用量有可能增多或减少，需要根据第一次的结果（见注），2 次扩增的反应条件需要根据第一次扩增的结果来调整，常用的是 25 个循环：94°C (30s)、50°C(30s )、72°C ( 5 min)。循环的次数也可以根据结果来调整（见注）。
( 2 ) 结果用琼脂糖凝胶来检测。成功的筛选是出现一条正确大小的条带（对于聚合酶，是 2.5 kb) ，而在负对照中不应出现条带 [ 见注 5 和注 6 ]。
CSR 的条带可进一步切胶纯化，再次酶切，重新克隆到载体 pASK75 上。然后转化到 TG1 [ 见 14.2 ( 1 ) ]，转化的产物或者按 14.3.7 所描述的方法筛选，或者按 14.3.2~14.3.6 中所描述的方法培养、诱导，为下一轮的选择做准备。
3.7 Taq 聚合酶的快速筛选
( 1 ) 为了筛选突变体，转化的克隆在 TYE-Amp 平板上扩增 [ 见 14.2 (3)]，然后接种到 96 孔板上，每孔含有 100 μl 的 2X TYA [ 见 14.2( 2 ) ] 。
( 2 ) 上述 96 孔板培养 6~10 h 以后，即加入 20 μl 含有 1.2 μg/ml ACROS 的 2X TYA，继续培养 2~4 h，表达蛋白质。
( 3 ) 用排枪，从 96 孔的每个孔转移 2 μl 诱导的细胞到 30 μl 的 PCR 混合物中（见 14.3.3 和 14.3.4 ) ，该混合物也在一个 96 孔的 PCR 平板上。
( 4 ) 在 96 孔 PCR 平板中，每孔加入覆盖油，然后进行 PCR 反应 [ 见 14.3. 4 (2)]，可以将循环增加到 30 次，用来筛选活性比较弱的突变体。用野生型的作为对照很重要。阳性鉴定可在琼脂糖凝胶上进行。
3.1 用 Tet 启动子在细菌中表达 Taq 聚合酶
( 1 ) 挑取单克隆到 2 ml 的 2X TY [ 见 14.2 ( 2 ) ] 培养基中，并加入 0.1 mg/ml Amp，在 37°C 过夜培养。
( 2 ) 将上述培养液以 1: 100 的比例加入到新鲜的 2X TYA 37°C 培养，直到菌液 OD600 达到 0.6~0.9 ( 培养应不超过 2~3 h)。
( 3 ) 加入 ACROS ( 非毒性四环素衍生物），终浓度为 0.2 μg/ml 到步骤（2 ) 培养液中，诱导 pASK75 种的 Tet 启动子，表达蛋白质。
( 4 ) 在 37°C 持续摇菌 2~4 h。
3.2 收集表达了聚合酶的细胞
( 1 ) 在离心机中 [ 1300 rcf ( 3000 r/min)，15 min ] 离心细胞，去掉上清液，用与培养基相同体积的 1 X Tag 缓冲液轻轻地悬浮细胞。
( 2 ) 重复离心收集细胞和重悬细胞，这次重悬细胞使用 1/10 培养基体积的 1X Taq 缓冲液。
( 3 ) 检测 OD600 的吸收值，确定细胞的个数（OD600 = 1 相当于 8 X 108 个细胞/ml)。
3.3 建立 CSR
( 1 ) 将水相的 CSR 在冰上加入到 1X Tag 缓冲液，加入 1 μmol/L 引物 1 和 2、0.25 mmol/L dNTP、50 μmol/L TMAC ( 可选；见注 1 )、0.05% ( V/V ) 不含脱氧核糖核酸酶的胰腺核糖核酸酶（可选）和诱导表达的细胞（终浓度为 1X109 个细胞/ml)。
( 2 ) 准备油相 CSR，混合轻矿物油、4.5%（V/V）Span 80、0.4% ( V/V ) Tween-80、0.05% ( V/V ) Triton X-100，在室温下持续搅拌。由于表面剂的高黏性，需要准备一个大体积油相 CSR ( 大于 50 ml) ，并且用切断吸管尖去掉表面活性物质。油相的 CSR —旦准备好，可以在黑暗的室温中存放 1 个月。
( 3 ) 将 200 μl 的水相 CSR 加入到 400 μl 油相 CSR，加入过程中要用点滴的方法 ( 每滴 5~10 μl，间隔 5s)，整个过程在 2 ml 的平底管中进行，需要用磁力搅拌器 ( 1000 r/min) 不停地搅拌。
( 4 ) 加入最后 1 滴后，持续搅拌 5 min。最后需要乳化成白色的并且有黏性的状态 ( 见注2 )。
3.4 CSR
( 1 ) 转移乳化液到 0.5 ml 薄壁 PCR 管（100 μl/管），然后加入 2 滴矿物油，防止挥发（见注 3) 。
( 2 ) 进行 PCR 反应，94°C 5 min，裂解细胞，破坏其他酶的活性，然后进行如下 20 个循环：94°C ( 1 min ) ，60°C ( 1 min ) ，72°C ( 5 min)。
PCR 完毕后，乳化相应该仍是白色的，上面覆盖了一层油相。体积可能会减少，但不表明乳化的隔室发生合并。乳化相的聚合或破碎直接表现为白色的乳化相之下有个明显的水相层。这时候就表明有很多因素干扰了乳化相的稳定，如各种成分混合的不充分。
3.5 实施
( 1 ) 用 2 倍体积（200 μl ) 的二乙醚，来分离水相的 CSR。漩涡振荡混合物 20s，然后在 20000 rcf ( 13000 r/min) 离心 2 min。
( 2 ) 出现两个液体层。小心地移动有机相下面的水相层，然后转移到一个新的 1.5 ml EP 管中。
CSR 的反应可以通过两种不同的方法来实施。
3.5.1 PEG 抽提方法
( 1 ) 用苯酸 -氯仿（1/1，V/V ) 来萃取液相层，然后接着用氯仿-异戊醇（24/1，V/V）来萃取。
( 2 ) 在液相层，加入 0.5 个体积的 PEG800/MgCl2 溶液 [ 见 14.2 ( 13 ) ]，然后用吸量管上下反复混匀几次。
( 3 ) 室温，20000 rcf (13000 r/min) 离心 10 min。去掉上清液（含有剩余的引物和 dNTP），沉淀用 TE 重悬[ 见 14.2(14)]。
( 4 ) 遗留的聚合酶，在加入 20~50 U DpnI 到液相层中，37°C 放置 1 h 后，其量可减少（见注 4)。
( 5 ) 为了确保完全去除引物，进一步利用 PCR 纯化试剂盒（Qiagen) ，纯化液相层中的 CSR 产物。用 35% ( V/V ) 盐酸胍洗 2 次，保证完全去除残留的引物。最后将纯化的产物加到 50 μl 的缓冲液 EB 中 [ Qiagen；见 14.2 (16)]。
3.5.2 快速实施
( 1 ) 利用 14.3.5.1 步骤（5 ) 中的方法，用 PCR 纯化试剂盒纯化 CSR 产物。用 35% ( V/V ) 盐酸胍洗 2 次，保证完全去除残留引物。最后将纯化的产物加到 50 μl 的缓冲液 EB 中。
( 2 ) 取 7 μl 的产物，加入 1 μl 的 10 X Taq 缓冲液、1 μl 的 20 U/μl DpnI 以及 1 μl ExoSAP，然后在 37°C 放置 1 h，接着在 85°C 放置 15 min。
3.6 提取
( 1 ) 使用外侧巢式引物 3 和 4，2 次扩增需要筛选的基因。20% 的需要筛选的产物被加入 50 μl 的 PCR 反应液中（即 10 μl 的纯化产物加入到 50 μl 溶液中）。但是，这个用量有可能增多或减少，需要根据第一次的结果（见注），2 次扩增的反应条件需要根据第一次扩增的结果来调整，常用的是 25 个循环：94°C (30s)、50°C(30s )、72°C ( 5 min)。循环的次数也可以根据结果来调整（见注）。
( 2 ) 结果用琼脂糖凝胶来检测。成功的筛选是出现一条正确大小的条带（对于聚合酶，是 2.5 kb) ，而在负对照中不应出现条带 [ 见注 5 和注 6 ]。
CSR 的条带可进一步切胶纯化，再次酶切，重新克隆到载体 pASK75 上。然后转化到 TG1 [ 见 14.2 ( 1 ) ]，转化的产物或者按 14.3.7 所描述的方法筛选，或者按 14.3.2~14.3.6 中所描述的方法培养、诱导，为下一轮的选择做准备。
3.7 Taq 聚合酶的快速筛选
( 1 ) 为了筛选突变体，转化的克隆在 TYE-Amp 平板上扩增 [ 见 14.2 (3)]，然后接种到 96 孔板上，每孔含有 100 μl 的 2X TYA [ 见 14.2( 2 ) ] 。
( 2 ) 上述 96 孔板培养 6~10 h 以后，即加入 20 μl 含有 1.2 μg/ml ACROS 的 2X TYA，继续培养 2~4 h，表达蛋白质。
( 3 ) 用排枪，从 96 孔的每个孔转移 2 μl 诱导的细胞到 30 μl 的 PCR 混合物中（见 14.3.3 和 14.3.4 ) ，该混合物也在一个 96 孔的 PCR 平板上。
( 4 ) 在 96 孔 PCR 平板中，每孔加入覆盖油，然后进行 PCR 反应 [ 见 14.3. 4 (2)]，可以将循环增加到 30 次，用来筛选活性比较弱的突变体。用野生型的作为对照很重要。阳性鉴定可在琼脂糖凝胶上进行。
来源：丁香实验
