分隔式自我复制：聚合酶和其他酶的定向进化的一个新方法
丁香园
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1. 引言
自我复制，忠实地拷贝自身的基因组，这是所有生命的一个确定的特性。在当今的生命体中，这个最基本的生命活动由不同种类的多核苷酸聚合酶来实现 [1] 。除了基因组的扩增外，多核苷酸聚合酶还有一系列核心的生物功能，包括转录、DNA 修复以及端粒维持。近年来，人们发现某些特殊的聚合酶参与很多不同的生命活动，包括从适应突变、抗体亲和力成熟到抵抗紫外线引起的 DNA 损伤 [2]，而且，还有可能参与 RNA 干扰。异常的聚合酶功能可引起癌症的发生 [4]，许多聚合酶，尤其是病毒的聚合酶，是重要的药物靶标。最后，聚合酶处于现代生物技术发展的中心位置，它用于 DNA 测序、聚合酶链反应、定点突变、DNA 克隆；而且聚合酶还主要应用于新兴技术，如分子计算学和纳米生物技术。我们相信对聚合酶功能理解得更全面，不仅可以 帮助我们更深入理解一些生命活动的机制，而且还能使其更广泛用于生物技术领域， 还有可能加速设计出抗病毒的药物。
虽 然 T.Steitz 和其他科学家对聚合酶进行了三维结构上的研究，而且人们对其生化方面以及野生型和突变型的酶动力学方面也都有了细致的研究，但是在我们想按自 己的意愿改变聚合酶的性质或为了新的用途设计一些聚合酶这些方面，其发展仍然很滞后 [5]。
1.1 通过蛋白质设计实现聚合酶工程技术
通过蛋白质工程技术，可以改变聚合酶的功能特性。例如，通过删除全部或部分的 Tag 聚合酶上的 5 —3' 核酸外切酶结构域，得到变异的 Tag 聚合酶（Stoffel fragment 和 Klentaq)；该变异的聚合酶增加了热稳定和 DNA 复制的保真度，但 DNA 持续合成的能力降低 [ 6，7] 。进一步，高分辨率的聚合酶结构的获得可以通过合理设计一些改进聚合酶性质的突变体来实现（如在 DNA 循环测序中，Tag 的突变体增强了双脱氧核酸的整合；参考文献 [8])。定点突变也可以得到聚合酶的变异体，从而使聚合酶增加了整合核苷酸的能力 [ 9，10 ]、减少了 DNA 复制的中止 [11] 以及改变了 DNA 复制的保真性。将 T7 DNA 聚合酶的硫氧还蛋白结合环移植到 DNA 聚合酶Ⅰ上 ，可以显著增强复制的持续性 [13]。
1.2 通过功能筛选实现聚合酶工程技术
遗传学的方法也已应用到聚合酶的设计中。例如，Loeb 和他的同事通过 polA12、recA 718 菌株与 Tag 聚合酶、人类免疫缺陷病毒反转录酶和人类 pol β 的互补实验，选出了有活性的变异聚合酶。互补实验筛选被用来检测聚合酶活性位点的可变性，并且用来筛选出有不同特性的聚合酶突变体，如选出保真度降低的突变体或整合 核苷酸能力增强的突变体。最近，这种方法被用在 RAD 30、RAD 52 酵母株中对 pol η ) 功能的筛选上，并找到了 pol η 活性增强的突变体 [17]。
噬菌斑展示技术在功能筛选方面是个很成功的方法，尤其是该方法可应用在分子相互作用的定向进化方面。例如，该方法在分离肽激素模拟物和人类 V-基因特异的抗体筛选中的应用。近来，噬菌斑展示技术通过在噬菌斑中展示底物和酶，可以用来选 择酶的不同催化活性。这种方法被 Jestin 和 Winter 成功用来富集有活性的聚合酶，通过在模板-引物双链体中加入有标签的核苷酸到噬菌体颗粒中 [18]。不久前 ，Romesberg 和他的合作者采用类似的方法对 Stoffel 基因进行了筛选 [19]，筛选出的 Stoffel 某个片段整合 rNTP 的效率接近野生型的酶。
虽然遗传互补方法严重的限制了该方法的使用范围，但噬菌斑展示技术显示出了多方面的适用性。但是，噬菌斑展示技术筛选条件需要受噬菌体存活条件的影响，而且噬菌体内在的分子可以降低聚合酶与模板-引物二链体的亲和性以及聚合酶复制的持续性。这两种方法都有能力检测出很弱的聚合酶活性，仅仅一个 dNTP 整合也能被筛选出来。
1.3 通过分隔式自我复制实现聚合酶工程技术
我们在酶的进化，特别是聚合酶的进化方面，发明了一种新方法，称为分隔式自我复制（CSR，参考文献[20])。在 CSR 中，每个不同的聚合酶突变体在不同的隔离空间。使用合适的试剂，使每个聚合酶只复制编码自身的基因，而不受外界的影响 ( 也就是说，自我复制；图 14.1)。相应地，只有编码有活性的聚合酶的基因才能复制；失活的聚合酶不能复制，从而在基因池中消失。不同活性的突变体，活性越高的突变产生越多的自身基因的拷贝数（即产生更多的 “子代” 基因）。结果，聚合酶在复制后，其拷贝数反映了在给定的条件下其聚合酶活性的高低。这样，最适应选择条件的聚合酶有最大的活性，从而在基因池中占有最主要的地位。
物理上分离的隔室，主要保证在 CSR 中表型和基因型正确对应关系（即保证每个聚合酶特性的改变，只能反映在其复制自身基因的行为上)。分隔空间的完整性在选择的进程中不能破坏，一些来自噬热物种的聚合酶，如 Tag 酶，需要长时间地在高温下，也需要保证分隔空间的完整性。其次，分隔室不能有大分子之间的交换，如 DNA 或蛋白质 ( 小分子的交换是允许的，在某些情况下，还是有利的）。许多不同的方法用来保证酶反应的空间封闭性，如脂质囊泡 [21] 。我们使用的是油包水乳化剂 [22]。我们改进了表面活性剂的成分和油水相的比例，增加了其热稳定性和 CSR 产物的生成。乳化剂在温度超过 90°C 时，稳定了体系，而且乳化-PCR 反应与溶液-PCR 反应的产物量基本接近 [ 20 ]。
CSR 乳化剂的高稳定性，可允许其在更宽广的实验条件下进行蛋白酶活性的选择。CSR 可严格选择聚合酶的活性：在一个筛选中，Taq 野生型聚合酶稀释到 1/106，其活性比失活的 Taq 突变体（D785H/E786V ) 还高。这些使得 CSR 成为聚合酶定向进化的一个强有力的方法。实际上，以两个 Tag 基因的随机突变库为基础，每个仅仅用 CSR 进行 3 个回合的试验，我们就得到了增强 11 倍热稳定性的 Tag 聚合酶突变体；还得到了增强 130 倍的对肝素有抵抗的 Tag 聚合酶突变体，而肝素是一个对所有聚合酶都有很强的抑制性，并广泛使用的抗凝血剂 [20]。
我们希望 CSR 和其他方法在聚合酶的定性选择方面有更多的应用，包括设计一些聚合酶，使其满足更多的应用领域。例如，染料中止测序、临床或法医诊断 PCR、突变试验等。聚合酶的稳定性、对抑制剂的抵抗性、复制持续性、保真性、对模板-引物双链体的亲和性、底物特异性等都是可以改变的，聚合酶可以在已有应用领域上进行扩展。例如，聚合酶对底物的特异性的改变，可以允许其结合更多的遗传字母，允许核酶和脱氧核酶的体外进化，而且可以帮助改进快速单分子测序的方法。最后，聚合酶不仅可以扩展自身底物的特异性，而且可以改变聚合酶本身的化学性质，这使其可以创造出与目标序列类似的 DNA-like 的聚合体，这样就可以按照人为的意愿进行 DNA 复制。从而，可以将分子进化领域扩展到材料科学领域。
自我复制和分隔也被用来重现分子自组织和生物前进化中的情景。特别地，一种巧妙的选择策略被用来重现 RNA-based 的 RNA 复制酶进行的自我复制。Bartel 和 Joy 的实验组已经成功地创造出不同的核酶，这些核酶可以直接在模板上加入核苷酸 [ 23，24 ] 。 一旦 RNA 复制酶被创造，分隔式自我复制（或其他方法）仅仅需要保证复制的是自身的 RNA，阻止其他污染的 RNA 进入体外复制系统。
最后，CSR 不仅应用在聚合酶上，还可以经过催化网络应用于其他酶上。我们将 CSR 应用于核苷酸二磷酸激酶（ NDK ) 的筛选上，NDK 和 Taq 聚合酶可完成一对互逆的催化反应，NDK 可生成三磷酸核苷酸，三磷酸核苷酸是聚合酶复制基因所必需的 [ 20 ]。结果，只能有活性的 ndk 基因可以复制。CSR 还可以整合单酶或反应通路的进化。基于 CSR 的 “聚合酶工程”，一个通用的选择酶活的系统试图被建立起来，希望将酶活反应与聚合酶的底物或抑制剂联系起来。因此，只要合适的底物能在 CSR 基本的回路中，CSR 就可用于对任何酶的筛选。
总之，CSR 是一个强有力的新的用来筛选酶活性的方法，我们希望 CSR 在酶的定向进化，特别是聚合酶的定向进化方面有更多的应用，以及在体外进化和分子协同方面的遗传学研究上也有应用。这里，我们详细地描述了以作为表达菌株，Tag 聚合酶作为靶蛋白，用 CSR 来选择新特性聚合酶的实验流程。
2. 材料
( 1 ) E.coli 抑制菌株 TG1 ( K12、△ [ lac-pro]、supE、thi、hsdD5/F' traD36、proA+B+、lacIq、lacZ△M15）用来扩增质粒和聚合酶的表达。
( 2 ) 2X TY 培养基（1 L；参考文献 [26])：16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母提取物和 5 g 氯化钠；以及 0.1 mg/ml 氨 芐青霉素（Amp；2X TYA)。
( 3 ) TYE 平板（1 L；参考文献 [ 26 ])：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、8 g NaCl 和 15 g 氯化钠；以及 0.1 mg/ml 氨苄青霉素。
( 4 ) 脱水四环素（ACROS)。
( 5 ) 10X Super Tag 聚合酶缓冲液（HT Biotech，Cambridge，UK)。
( 6 ) 四甲基氯化铵（TMAC；Sigma)。
( 7 ) 不含 DNA 酶的胰腺 RNA 酶（Roche)。
( 8 ) CSR 油相：4.5% ( V/V ) Span 80 ( Fluka)、0.4% ( V/V ) Tween-80 ( Sigma) 和 0.05% ( V/V ) Triton X-100 ( Sigma) 在轻矿物油中（Sigma；如何准备参见 14.3.3)。
( 9 ) 2 ml 圆底生物冷冻瓶（Costar，Cambridge MA)。
( 10 ) 磁力搅拌器。
( 11 ) 薄壁 PCR 管（Roche)。
( 12 ) 二乙醚（Sigma)。
( 13 ) 聚乙二醇（PEG) 800/MgCl2 溶液：30% ( V/V）PEG 800 ( BDH Biochemical ) 和 30 mmol/L MgCl2。
( 14 ) Tris-HCl-EDTA（TE ) 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0 和 1 mmol/L EDTA。
( 15 ) 20 U/μl Dpnl ( New England Biolabs)。
( 16 ) PCR 纯化试剂盒 Qiagen。
( 17 ) EB (Qiagen)：10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
( 18 ) ExoSap (USB)。
4. 注
1. TMAC 用来增加引物的特异性，在某些情况下不是必需的。
2. 为了测试新淮备的油相，标准的 PCR 反应可使用 14.3.3 和 14.3.4 中的实验流程。在乳化相中的 PCR 反应产物的量应当与非乳化相 PCR 反应的产物差不多。在 PCR 反应过程中，乳化相不能有明显的破坏，一般根据是否在 PCR 管底部形成一个清晰的水相层来判断。
3. 如果 PCR 反应没有使用油覆盖或是使用了加热盖，CSR 的产量会变少。
4. 甲基化的质粒 DNA 在筛选的过程中可以作为非特异的模板，所以需要被去除。非甲基化的扩增产品不需要被去除。
5. 在所有的 CSR 筛选中，阴性对照是很重要的。不加入 dNTP 的 CSR 反应，是一个理想的负对照。通过重复扩增，在负对照中，不应出现可见的扩增产物。若是出现筛选产物，表明没有完全去除引物和质粒。
6. 如果两次扩增出现了很弱的信号，那么外侧巢式引物 3 或 4 需要与基因特异性的引物一起使用，这样有时可以增强特异的信号。在任何情况下，包括一 dNTP 的负对照都是很重要的。
参考文献
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自我复制，忠实地拷贝自身的基因组，这是所有生命的一个确定的特性。在当今的生命体中，这个最基本的生命活动由不同种类的多核苷酸聚合酶来实现 [1] 。除了基因组的扩增外，多核苷酸聚合酶还有一系列核心的生物功能，包括转录、DNA 修复以及端粒维持。近年来，人们发现某些特殊的聚合酶参与很多不同的生命活动，包括从适应突变、抗体亲和力成熟到抵抗紫外线引起的 DNA 损伤 [2]，而且，还有可能参与 RNA 干扰。异常的聚合酶功能可引起癌症的发生 [4]，许多聚合酶，尤其是病毒的聚合酶，是重要的药物靶标。最后，聚合酶处于现代生物技术发展的中心位置，它用于 DNA 测序、聚合酶链反应、定点突变、DNA 克隆；而且聚合酶还主要应用于新兴技术，如分子计算学和纳米生物技术。我们相信对聚合酶功能理解得更全面，不仅可以 帮助我们更深入理解一些生命活动的机制，而且还能使其更广泛用于生物技术领域， 还有可能加速设计出抗病毒的药物。
虽 然 T.Steitz 和其他科学家对聚合酶进行了三维结构上的研究，而且人们对其生化方面以及野生型和突变型的酶动力学方面也都有了细致的研究，但是在我们想按自 己的意愿改变聚合酶的性质或为了新的用途设计一些聚合酶这些方面，其发展仍然很滞后 [5]。
1.1 通过蛋白质设计实现聚合酶工程技术
通过蛋白质工程技术，可以改变聚合酶的功能特性。例如，通过删除全部或部分的 Tag 聚合酶上的 5 —3' 核酸外切酶结构域，得到变异的 Tag 聚合酶（Stoffel fragment 和 Klentaq)；该变异的聚合酶增加了热稳定和 DNA 复制的保真度，但 DNA 持续合成的能力降低 [ 6，7] 。进一步，高分辨率的聚合酶结构的获得可以通过合理设计一些改进聚合酶性质的突变体来实现（如在 DNA 循环测序中，Tag 的突变体增强了双脱氧核酸的整合；参考文献 [8])。定点突变也可以得到聚合酶的变异体，从而使聚合酶增加了整合核苷酸的能力 [ 9，10 ]、减少了 DNA 复制的中止 [11] 以及改变了 DNA 复制的保真性。将 T7 DNA 聚合酶的硫氧还蛋白结合环移植到 DNA 聚合酶Ⅰ上 ，可以显著增强复制的持续性 [13]。
1.2 通过功能筛选实现聚合酶工程技术
遗传学的方法也已应用到聚合酶的设计中。例如，Loeb 和他的同事通过 polA12、recA 718 菌株与 Tag 聚合酶、人类免疫缺陷病毒反转录酶和人类 pol β 的互补实验，选出了有活性的变异聚合酶。互补实验筛选被用来检测聚合酶活性位点的可变性，并且用来筛选出有不同特性的聚合酶突变体，如选出保真度降低的突变体或整合 核苷酸能力增强的突变体。最近，这种方法被用在 RAD 30、RAD 52 酵母株中对 pol η ) 功能的筛选上，并找到了 pol η 活性增强的突变体 [17]。
噬菌斑展示技术在功能筛选方面是个很成功的方法，尤其是该方法可应用在分子相互作用的定向进化方面。例如，该方法在分离肽激素模拟物和人类 V-基因特异的抗体筛选中的应用。近来，噬菌斑展示技术通过在噬菌斑中展示底物和酶，可以用来选 择酶的不同催化活性。这种方法被 Jestin 和 Winter 成功用来富集有活性的聚合酶，通过在模板-引物双链体中加入有标签的核苷酸到噬菌体颗粒中 [18]。不久前 ，Romesberg 和他的合作者采用类似的方法对 Stoffel 基因进行了筛选 [19]，筛选出的 Stoffel 某个片段整合 rNTP 的效率接近野生型的酶。
虽然遗传互补方法严重的限制了该方法的使用范围，但噬菌斑展示技术显示出了多方面的适用性。但是，噬菌斑展示技术筛选条件需要受噬菌体存活条件的影响，而且噬菌体内在的分子可以降低聚合酶与模板-引物二链体的亲和性以及聚合酶复制的持续性。这两种方法都有能力检测出很弱的聚合酶活性，仅仅一个 dNTP 整合也能被筛选出来。
1.3 通过分隔式自我复制实现聚合酶工程技术
我们在酶的进化，特别是聚合酶的进化方面，发明了一种新方法，称为分隔式自我复制（CSR，参考文献[20])。在 CSR 中，每个不同的聚合酶突变体在不同的隔离空间。使用合适的试剂，使每个聚合酶只复制编码自身的基因，而不受外界的影响 ( 也就是说，自我复制；图 14.1)。相应地，只有编码有活性的聚合酶的基因才能复制；失活的聚合酶不能复制，从而在基因池中消失。不同活性的突变体，活性越高的突变产生越多的自身基因的拷贝数（即产生更多的 “子代” 基因）。结果，聚合酶在复制后，其拷贝数反映了在给定的条件下其聚合酶活性的高低。这样，最适应选择条件的聚合酶有最大的活性，从而在基因池中占有最主要的地位。
物理上分离的隔室，主要保证在 CSR 中表型和基因型正确对应关系（即保证每个聚合酶特性的改变，只能反映在其复制自身基因的行为上)。分隔空间的完整性在选择的进程中不能破坏，一些来自噬热物种的聚合酶，如 Tag 酶，需要长时间地在高温下，也需要保证分隔空间的完整性。其次，分隔室不能有大分子之间的交换，如 DNA 或蛋白质 ( 小分子的交换是允许的，在某些情况下，还是有利的）。许多不同的方法用来保证酶反应的空间封闭性，如脂质囊泡 [21] 。我们使用的是油包水乳化剂 [22]。我们改进了表面活性剂的成分和油水相的比例，增加了其热稳定性和 CSR 产物的生成。乳化剂在温度超过 90°C 时，稳定了体系，而且乳化-PCR 反应与溶液-PCR 反应的产物量基本接近 [ 20 ]。
CSR 乳化剂的高稳定性，可允许其在更宽广的实验条件下进行蛋白酶活性的选择。CSR 可严格选择聚合酶的活性：在一个筛选中，Taq 野生型聚合酶稀释到 1/106，其活性比失活的 Taq 突变体（D785H/E786V ) 还高。这些使得 CSR 成为聚合酶定向进化的一个强有力的方法。实际上，以两个 Tag 基因的随机突变库为基础，每个仅仅用 CSR 进行 3 个回合的试验，我们就得到了增强 11 倍热稳定性的 Tag 聚合酶突变体；还得到了增强 130 倍的对肝素有抵抗的 Tag 聚合酶突变体，而肝素是一个对所有聚合酶都有很强的抑制性，并广泛使用的抗凝血剂 [20]。
我们希望 CSR 和其他方法在聚合酶的定性选择方面有更多的应用，包括设计一些聚合酶，使其满足更多的应用领域。例如，染料中止测序、临床或法医诊断 PCR、突变试验等。聚合酶的稳定性、对抑制剂的抵抗性、复制持续性、保真性、对模板-引物双链体的亲和性、底物特异性等都是可以改变的，聚合酶可以在已有应用领域上进行扩展。例如，聚合酶对底物的特异性的改变，可以允许其结合更多的遗传字母，允许核酶和脱氧核酶的体外进化，而且可以帮助改进快速单分子测序的方法。最后，聚合酶不仅可以扩展自身底物的特异性，而且可以改变聚合酶本身的化学性质，这使其可以创造出与目标序列类似的 DNA-like 的聚合体，这样就可以按照人为的意愿进行 DNA 复制。从而，可以将分子进化领域扩展到材料科学领域。
自我复制和分隔也被用来重现分子自组织和生物前进化中的情景。特别地，一种巧妙的选择策略被用来重现 RNA-based 的 RNA 复制酶进行的自我复制。Bartel 和 Joy 的实验组已经成功地创造出不同的核酶，这些核酶可以直接在模板上加入核苷酸 [ 23，24 ] 。 一旦 RNA 复制酶被创造，分隔式自我复制（或其他方法）仅仅需要保证复制的是自身的 RNA，阻止其他污染的 RNA 进入体外复制系统。
最后，CSR 不仅应用在聚合酶上，还可以经过催化网络应用于其他酶上。我们将 CSR 应用于核苷酸二磷酸激酶（ NDK ) 的筛选上，NDK 和 Taq 聚合酶可完成一对互逆的催化反应，NDK 可生成三磷酸核苷酸，三磷酸核苷酸是聚合酶复制基因所必需的 [ 20 ]。结果，只能有活性的 ndk 基因可以复制。CSR 还可以整合单酶或反应通路的进化。基于 CSR 的 “聚合酶工程”，一个通用的选择酶活的系统试图被建立起来，希望将酶活反应与聚合酶的底物或抑制剂联系起来。因此，只要合适的底物能在 CSR 基本的回路中，CSR 就可用于对任何酶的筛选。
总之，CSR 是一个强有力的新的用来筛选酶活性的方法，我们希望 CSR 在酶的定向进化，特别是聚合酶的定向进化方面有更多的应用，以及在体外进化和分子协同方面的遗传学研究上也有应用。这里，我们详细地描述了以作为表达菌株，Tag 聚合酶作为靶蛋白，用 CSR 来选择新特性聚合酶的实验流程。
2. 材料
( 1 ) E.coli 抑制菌株 TG1 ( K12、△ [ lac-pro]、supE、thi、hsdD5/F' traD36、proA+B+、lacIq、lacZ△M15）用来扩增质粒和聚合酶的表达。
( 2 ) 2X TY 培养基（1 L；参考文献 [26])：16 g 胰蛋白胨、10 g 酵母提取物和 5 g 氯化钠；以及 0.1 mg/ml 氨 芐青霉素（Amp；2X TYA)。
( 3 ) TYE 平板（1 L；参考文献 [ 26 ])：10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、8 g NaCl 和 15 g 氯化钠；以及 0.1 mg/ml 氨苄青霉素。
( 4 ) 脱水四环素（ACROS)。
( 5 ) 10X Super Tag 聚合酶缓冲液（HT Biotech，Cambridge，UK)。
( 6 ) 四甲基氯化铵（TMAC；Sigma)。
( 7 ) 不含 DNA 酶的胰腺 RNA 酶（Roche)。
( 8 ) CSR 油相：4.5% ( V/V ) Span 80 ( Fluka)、0.4% ( V/V ) Tween-80 ( Sigma) 和 0.05% ( V/V ) Triton X-100 ( Sigma) 在轻矿物油中（Sigma；如何准备参见 14.3.3)。
( 9 ) 2 ml 圆底生物冷冻瓶（Costar，Cambridge MA)。
( 10 ) 磁力搅拌器。
( 11 ) 薄壁 PCR 管（Roche)。
( 12 ) 二乙醚（Sigma)。
( 13 ) 聚乙二醇（PEG) 800/MgCl2 溶液：30% ( V/V）PEG 800 ( BDH Biochemical ) 和 30 mmol/L MgCl2。
( 14 ) Tris-HCl-EDTA（TE ) 缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0 和 1 mmol/L EDTA。
( 15 ) 20 U/μl Dpnl ( New England Biolabs)。
( 16 ) PCR 纯化试剂盒 Qiagen。
( 17 ) EB (Qiagen)：10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
( 18 ) ExoSap (USB)。
4. 注
1. TMAC 用来增加引物的特异性，在某些情况下不是必需的。
2. 为了测试新淮备的油相，标准的 PCR 反应可使用 14.3.3 和 14.3.4 中的实验流程。在乳化相中的 PCR 反应产物的量应当与非乳化相 PCR 反应的产物差不多。在 PCR 反应过程中，乳化相不能有明显的破坏，一般根据是否在 PCR 管底部形成一个清晰的水相层来判断。
3. 如果 PCR 反应没有使用油覆盖或是使用了加热盖，CSR 的产量会变少。
4. 甲基化的质粒 DNA 在筛选的过程中可以作为非特异的模板，所以需要被去除。非甲基化的扩增产品不需要被去除。
5. 在所有的 CSR 筛选中，阴性对照是很重要的。不加入 dNTP 的 CSR 反应，是一个理想的负对照。通过重复扩增，在负对照中，不应出现可见的扩增产物。若是出现筛选产物，表明没有完全去除引物和质粒。
6. 如果两次扩增出现了很弱的信号，那么外侧巢式引物 3 或 4 需要与基因特异性的引物一起使用，这样有时可以增强特异的信号。在任何情况下，包括一 dNTP 的负对照都是很重要的。
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