细胞问题解答集锦

1、舒林酸和尼美舒利的溶解方法的问题：

问：最近在做试验时发现舒林酸和尼美舒利两种药物很难溶解，加入DMSO后可以溶解，但是再加入1640培养液稀释时又出现结晶，而且很难溶解。有什么好的办法吗？

答：(1)可以先把所需药母液加如一个小安剖瓶，再加入培养基，用枪多吹打几分钟就会溶解。

(2)如果还是溶解不了，可以换用乙醇试试。

(3)配制药母液时浓度要尽量高，这样稀释后培养基中的DMSO浓度才越低。

2、细胞因子加入剂量的问题：

问：已经知道某个细胞因子在体内正常的血清浓度为10-12IU/L，临床常用治疗剂量为100IU/kg。现在我们想研究该细胞因子对体外细胞功能的影响。如何决定细胞培养中的该细胞因子加入剂量，谢谢！并请提供原理！

答：临床用药浓度和细胞培养的药物干预浓度无法直接换算，有两方面原因，一是临床用药剂量不等同于血药浓度，即使是已知的血药浓度，也不等同于作用于靶器官/细胞的药物浓度。二是体外细胞学实验是药物作用于孤立的细胞，而细胞在体内要受到众多因素和内环境的影响，对药物的敏感性会有很大的不同。

所以你的问题很难回答，常规的实验思路是这样的：

(1)体外实验，研究药物对细胞是否有作用，如有作用，测出其量效关系和时效关系，进一步研究其作用机理。

(2)体内实验之前，研究一下该药物在体内的药代动力学，毒性等。

(3)动物体内实验，研究药物作用的有效剂量给药方式，进一步阐述其机理。

(4)临床实验。

所以对于你的问题，我的想法是，不必拘泥于同临床用药剂量一致性的问题。以该药物的血清浓度为标尺(10-12IU/L)，上下呈10倍药物浓度浮动，如0.001 IU/L、0.01 IU/L、0.1 IU/L、1 IU/L、10 IU/L、100 IU/L做一次六孔板实验，得到大致的有效浓度范围后，按此道理再做一次六孔板实验(倍比关系)，就可以确定其作用的量效关系了。最后选定理想的作用剂量研究其对细胞具体功能的影响和机制等。

3、细胞培养中的现象问题：

问：现在做系膜细胞实验，细胞复苏后长势良好，隔一天换液时发现培养瓶底有一层薄膜，晃动培养瓶后，有一张完整的膜脱落，培养液没有变混浊，以为是细胞脱壁呢，去掉膜后观查发现细胞还在，已经快长满一瓶了，然后进行传代，第二天观察发现传的六瓶细胞中有三瓶细胞中又出现了类似的膜。是为什么？

答：我以前也碰过，我认为可能是传的细胞太多，细胞粘连在一起，可能是死亡细胞，以前做流式的时候碰过，也有可能是消化的时候加入胰酶后放的时间太长所致。

4、纯化急性分离的成年大鼠心肌细胞及鉴别方式的问题：

问：我用Langendorff装置通过胶原酶好不容易分离出了成年大鼠心肌细胞，但文献讲这样分的心肌细胞中还有很多杂细胞(成纤维，内皮细胞)，我要用这批细胞做流式，需要纯化并鉴别纯度，我查了文章好像用了6%bsa沉降法来纯化的，具体怎样操作呢？

答：我们用胶原酶分离下来细胞后，用200目滤网过滤，待细胞自然沉降，得长杆状细胞就是，好像不用分离纯化。

5、问：线粒体特异性的标记物有哪些？

答：可以用JANUS GREEN B(詹那斯绿)染，线粒体中的细胞色素氧化酶可以氧化其成蓝绿色。这是活体线粒体特异性染料。你的目的是否与此有关？

6、MTT法测细胞黏附率的问题：

问：不少文章提到在他们使用MTT法测细胞黏附率或黏附抑制率时，将细胞种入96孔板孵育前，都预先按分组要求，将细胞与干预药物先一起加入试管中或24孔板中孵育30min，然后再种入96孔板中孵育90min或以上，才测OD值。为什么不一次就加到96孔板中，而是先放在试管或24孔板中孵育一段时间才种96孔板呢？是要起到什么作用呢？

答：预先让药物和细胞孵育，可以让药物充分地作用于细胞，对细胞贴壁功能有足够的影响后再测其粘附抑制率，这样结果比较真实。而直接将药物和细胞一次加到96孔板中，药物作用发挥得不会很充分。

7、线粒体提取问题：

问：我准备做液闪仪测心肌细胞线粒体ANT转运酶活性检测，想从培养所得的细胞中提取线粒体进行检测。看到过一些检测方法，但不知得率是多少，也没有看到出处，有哪位做过，能给个提取线粒体的方案吗？方便的话给个出处。我查到韩国的一篇文献上有方法，但需要超声破膜，我们这没有破膜机器，不方便，所以想找个不用超声破膜的方法。若提得线粒体，如何看它有没有活性呢？用詹那绿B就可以么？另外，因为接着要用液闪仪，可是从细胞里提线粒体是不是会很少啊，液闪仪大概需要多少样本量呢？

答：(1)提取新鲜心肌组织细胞内线粒体的方案：心肌组织切碎后在4℃介质(0.25mol/L蔗糖、10mmol/L Tris-HCl pH7.4、0-4℃)中制备心肌组织匀浆。匀浆经750g、离心10min后留上清，以9000g离心20min后留沉淀，重新悬浮后以9000g再离心20min，弃上清得线粒体.全部操作于4℃进行。

(2)培养细胞提取线粒体。细胞弃去培养液后，用细胞收集液作用2到3分钟，用scraper，将细胞收集起来，6000g，离心15分钟。弃上清，之后加细胞匀浆液，用匀浆器或手动匀浆管匀浆，将装有匀浆液的离心管配平后放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟，缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中。以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。加入0.25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol/L蔗糖与0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液，即得线粒体。

(3)液闪仪我没有用过，不过我觉得提取的线粒体数目应该足够你做(每个心肌细胞中都有>1000个的线粒体)。具体的上样标准我觉得需要查你使用的液闪仪的说明书。

8、问：盐酸乙醇该怎么配置呢？

答：0.5%的溶液应为重量百分比，即100g溶液中含有0.5g的盐酸溶液。由于浓盐酸的浓度不为100%，且乙醇溶液的密度不为1，所以楼上的配制方法得出的浓度为盐酸乙醇溶液(1->200)，而不是0.5%。

标准的配制方法应为：取一定体积的浓盐酸(约相当于HCl 5g，有浓度、密度，就可以计算出体积了)，加乙醇至100g，摇匀，即得。

9、微量全血培养的问题：

问：我现在想利用微量全血培养进行染色体畸变分析，在培养时加入全血0.3ml，但培养过程中感觉有溶血现象，细胞收集后量非常少。可以提供一些经验吗？

答：不知道你用的是什么培养基，我用1640培养，一般不溶血，加某些药物如PHA可促使溶血．实际上溶血对实验结果只有好处没有坏处的，全血可以做几个稀释梯度1:2、1:3、1:5等。细胞收集后量应该与这个也没有关系，一般1ml血大概只有10的6次方个细胞，还有就是细胞收集过程中容易出现问题。