血清中 miRNA 抽提和实验设计经验谈

人体内的血液循环系统犹如印度的圣河 – 恒河，河水中携带的养分滋养着古老的大地；洗涤带走地上的一切污秽，人们的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥着各种物质，有废物有养分，只要你想都可以从河水中捞取。同样的我们的循环系统如同恒河；流动的血液如同恒河水，身体所需的ㄧ切由血液运送，身体产生的废物也由血液清运，同样可以想象血中的成份也是包罗万象。

如果我们想知道大地有多纯净或污染有多严重，只要取一瓢水加以检视就可以知道答案；而相同的想了解人的生理状况，取一滴血加以检验也可以知道端倪，但是做这些检测并非漫无目标的，必须要知道哪ㄧ些物质是所谓的指针，在生物体内的这些指针就是我们熟知的生物标记(biomarker)。生物标记的研究和应用已有ㄧ段光景，各项代谢疾病的筛检广泛的被使用，而在癌症的筛检也已经有ㄧ些不错的生物标记，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。顺着 microRNA (miRNA) 的发现和研究热潮，已经约有 1000 个 miRNA 被发掘表现于人体中，miRNA 调控人体内基因表现的生理功能也为人们所熟知，加上 miRNA 相对于蛋白质标志的高稳定性，伴随着检测技术的一日千里，让血液中的 miRNA 表现成为新一代寻找生物标记的标的。本文内容介绍主要是血清 miRNA 的萃取和芯片实验所累积的经验，和读者分享实验上遇到的一些难题和解决的方法。

血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里去? 这些 miRNA 的生理功能是什么?以上这三个问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 结合诱导信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋白的表现。根据一些论文的揭示1和实验室实际的操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是极微量的，但是在病人和检体制备不佳的血液样本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据这些观察现象的合理臆测，病人血清中 miRNA 的来源，很有可能是因疾病造成的组织坏死或细胞凋亡破裂而流泄出来的胞内 miRNA，经由病人和正常人的基因表现的芯片图谱比较，结果也倾向有或无表现的差异，而非特定 miRNA 表现量上升；换言之，我们观察到相关的研究中，病人的 miRNA的表现数目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都有表现的 miRNA，表现量的高、低反而是其次的表征。

因此数据分析的逻辑和方法也必须根据之而调整，但这些呈现异位性表现(ectopic expression)的 miRNA 并不影响其成为诊断疾病和预后评估的标志的可能性。已经有一些研究指出，这些不经常表现在循环系统的 miRNA 可以成为良好的疾病诊断标志，如 miR-141 可以作为前列腺癌的指标，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞(myocardial infraction)相关，miR-122 和药物造成的肝脏损伤有关1。

临床上会根据检验的标的来选择血液检体的保存及制备方式，血清和血浆都是来自血液检体的成分，但是根据制备的方式导致本质上含有成分有所不同。基于制备的方法可知，血清是血液经由凝血反应后，再经由离心沈淀所得到的上清液。而血浆则是血液在不凝血的状况下，经由离心去除血球后的液体。

然而有文献指出，针对同一个人的血清和血浆样本抽提出来的 miRNA 的总量作比较，很明显的血清抽提的总量明显比血浆抽提的来得高，这意谓着制备的方法也会影响miRNA 的抽提，据推测这些 miRNA 可能是因为凝血反应，血小板或红血球破裂后释出的物质，其中包含 miRNA，虽然大部分的实时定量聚合链反应(q-PCR)验证结果显示，血浆和血液的 miRNA 的表现图谱并无显著差异，然而这个已经存在的风险，可能在研究设计也是需要被考虑，因此就理论上来说，是以血浆的检体较适合作为生物标记的找寻1。

已知血清或血浆中的 miRNA 的来源可能来自胞内和胞外，尤其是血球(红血球或白血球等)，因此处理方式不当会造成检体的污染，改变 miRNA 的组成和表现量，造成研究结果的偏差，尤其红血球的溶血现象影响甚剧，不仅会造成红血球 miRNA 污染而且红血球中的大片段 mRNA 亦会造成定量的失准和因降解而形成实验的伪阳性产生(图一)。

因此备制检体时也要避免造成血球破裂的动作，如用太细的针头抽血、或检体保存不当造成溶血、或病人本身因疾病或治疗造成的败血或溶血现象可能也是必须列入评估的考虑因素。此外抗凝血剂的使用必须避免使用含有肝素 heparin 的凝血管，已知 heparin 会抑制反转录 (reverse transcription) 和聚合酶 (polymerase) 的反应，如果检体会进行 q-PCR 的验证一定要避免。同样的血液检体也含有抑制反转录和聚合酶的成分，如果萃取时没有移除干净则会造成后续实验的失败产生。

在抽提成功的情形下，血清和血浆中仅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提总量可能都在 ng 甚或 pg 等级，这样的结果意谓着，运用现行的分亮度计来测 OD 是不可行的(以 NaroDrop 为例：待测浓度需高达10ng/uL才可信)，而Agilent bioanalyzer 2100 也仅能做到定性的检测，没法做精准的定量。检视现行被使用的定量方法大概有：

(一)在等体积的血清或血液样本中加入外控核酸(spike)，经由抽提步骤后可经由侦测外加的 spike 来校正抽提的总量及效率，作为校正检体因抽提效率或误差造成的差异。然而这只适用在检体备制完美及控制抽取技术无误，对于个体表现差异大和检体备制质量不一的检体，并没有办法达到管控的效用；

(二)经过分亮度计测 OD 加以定量，但是除非抽提出的量达到分亮度计的可信水平，否则这些数值大概都是假讯号，并不足以采信；

(三) 使用内控基因的表现量来做为校正。但根据研究指出其实血清或血浆中 miRNA 的表现数量是有很大的个体差异的，以正常人当研究对象分析其表现的 miRNA 数量，最低 123 个；最高有 296 个1，可以有高达两倍的差距，再加上没有适合的内控基因 (internal control gene) 可以做为控制组，公认常用的内控基因 U6 或 SNORD RNAs 等，在个体间的表现也是差异很大并不适用1,2。因此透过 Agilent Bioanalyzer 2100 的结果进行 miRNA相对定量；或从等体积血清抽提出 miRNA 再等比例取出进行实验，似乎是较可信的做法，但是还是要取决于实验的设计来决定。