TaKaRa RNAiso Reagent

本制品是一种快速方便的总RNA提取试剂，可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解，在加入氯仿离心后，溶液会形成上清层、中间层和有机层（下层)，RNA分布在上清层中，收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。

RNAiso Reagent具有很强的广谱性，可以适用于各种样品的总RNA提取，提取过程方便快速，整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高，基本不含蛋白质及基因组 DNA，提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。

【试剂盒之外所需准备试剂】

氯仿、异丙醇、75% 乙醇（ D E P C 处理水配制) 、RNase-free水（制备方法：使用RNase-free的玻璃瓶，向超纯水中加DEPC至终浓度0.01%（v/v)，过夜搅拌后，高温高压灭菌。）

保存和运输

1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月，为保证试剂质量，建议于2-8℃下避光保存。

2. 可以在常温下运输。

RNA提取实验前的准备

RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。

1. 用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。

2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

2. 实验样品的研磨和匀浆。

A. 贴壁培养细胞

① 倒出培养液，用1×PBS清洗一次。

② 每10 cm2 生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso

Reagent，水平放置片刻，使裂解液均匀分布于

细胞表面并裂解细胞，然后使用移液枪吹打细胞

使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。

③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞

① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中，8,000 g 4℃离心2分钟，弃上清。

② 向每5×106 个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。

C. 动物组织、植物材料样品

① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。

② 对于普通的RNA提取样品，可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent，将研磨成粉末状的样品完全覆盖， 然后室温静置，直至样品完全融化，再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品，如肝、脾、骨及软骨等，可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中进行匀浆，直至匀浆液呈无颗粒透明状。

③ 将匀浆液转移至离心管中，室温静置5分钟。

④ 12,000 g 4℃离心5分钟。

⑤ 小心吸取上清液，移入新的离心管中（切勿吸取沉淀)。

③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。

④ 室温静置5分钟。

3. 总RNA的提取。

① 向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用力震荡(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待充分乳化溶液呈乳白状（无分相现象)后，再室温静置5分钟。

② 12,000 g 4℃离心15分钟。

③ 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层,即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层)。

④ 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。

⑤ 12,000 g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。

4.RNA沉淀的清洗。

小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。

5. RNA的溶解。

室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则R N A 将会很难溶解， 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

RNA提取操作流程简图

FAQs

[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表：

[Q2] 有关RNA的吸光度说明如下：

260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。

[Q3] 如何计算RNA的浓度？

RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。

[Q4] 提取的RNA中含有多糖怎么办？

大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAiso Reagent的使用量。

[Q5] RNA提取量较低怎么办？

① 向组织材料中加入RNAiso Reagent后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。

② 相分离后请尽量完全回收上清液。

[Q6] 提取的RNA不溶怎么办？

① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。

② 可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。

③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，不要让枪头接触蛋白层。

④ 溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制)。

[Q7] OD260/OD280值<1.65，为什么？

① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。

② 样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。

③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。

③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Reagent的添加量不够。

④ 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。

⑤ RNA未充分溶解。

[Q8] 提取的RNA降解，为什么？

① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。

② 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。

[Q9] 提取的RNA中含有DNA污染，为什么？

① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent量偏少。

② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。

③ 如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I

(RNase Free；TaKaRa Code：D2215）进行DNA消化。

■ 参考文献

1. J. Chirgwin et al, "Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease", Biochemistry.18(24): 5294-5299(1979).

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