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端粒酶活性检测操作必知

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近几年来端粒酶由于与长寿、癌症等的研究相关联而备受关注,而端粒酶活性检测具体方法又有那些呢?小编整理了端粒酶活性检测的原理、基本操作技巧 、结果判断、扩增片段检测等方面内容,以飨读者。

端粒酶 (Telomerase)是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分(hTR)于1995年被克隆,其中含有端粒重复序列的模板(5′-CUAACCCUAAC-3′);蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性,结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟体细胞中端粒酶失活,同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性,而在癌旁组织和正常组织阳性率很低,推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。因此近几年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入,同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其检测方法综述如下。

1 基本原理

端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板,在适宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列,用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR 基础上的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol, TRAP)。TRAP反应原理见下图。

首先合成一个18nt的TS做上游引物,端粒酶 结合TS末端的GTT并合成agggttag,然后每经过一次转位合成一个ggttag的6碱基重复序列,端粒酶灭活后,加入一个24nt的CX做下游引物,经过多次变性-退火-延伸,扩增端粒酶延伸产物。

2 基本技术方法

2.1 标本来源 手术摘除组织,针吸活检组织,胸水,腹水,膀胱或胰管冲洗液,棉拭子所取分泌物和尿液(尚有争议)等。

2.2 端粒酶 的提取方法 早期采用超声等物理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差异较大,此后采用去污剂(如CHAPS)裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述如下:40~100mg冷冻(-70%℃)组织或104~106沉淀细胞用冰预冷的洗液[10mM hepes-KOH(pH7.5), 1.5mM MgCl2, 10mM KCI, 1Mm DTT]洗1次,10000g4℃离心1min,沉淀加200μl冷裂解液[10mM tris-HCI(Ph7.5), 1mM MgC12,1mM EGTA, 0.1mM PMSF, 5mM β-巯基乙醇,0.5%CHAPS,10%甘油],自动匀浆器冰浴中匀浆,450rpm,25min, 16000g4℃离心20min,移取上清160μl,部分样品用于蛋白定量,其余迅速冷冻,-70℃保存。端粒酶经小于10次冻融可保持活性稳定。部分学者对某些标本用0.5%Tween-20代替0.5%CHAPS获得更好的效果[2]。

2.3 TRAP扩增 50μlTRAP体系包含20mM tris-HCI(pH8.3),1.5mM MgCI,63mM, KCI, 0.005%Tween-20,1mM EGTA, 50μMdNTP,0.1μg tS,1μg T4基因32蛋白,0.1mg/ml牛血清白蛋白,1~2μlCHAPS细胞提取液(含6μg)蛋白,0.2~0.4μl[α-32P]dGIP或[α-32P]dGIP(10μCi/μl, 3000Ci/mmol),这一反应体系可同时满足端粒酶Tap聚合酶的活性需要,23℃10min合成端粒酶延伸产物后,94℃3s灭活端粒酶,加入0.1μg cX和2U Taq酶,94℃30s,50℃30s,72℃1.5min扩增27个循环,25μl产物进行15%PAGE 凝胶电泳。

2.4 引物设计 为了防止上、下游引物之间的结合,在CX引物上设计了3个不匹配碱基(见图undefined处),单链结合蛋白T4基因32蛋白可进一步避免引物之间的结合,TS和CX引物被广为采用,在上述条件下,只有延伸了三至更多的GGTTAG片断才有特异扩增,即得到从40bp开始的6bp差异的梯带。Broccoli等以5′-GGCGCG(ACCCTA)3-3′代替CX引物,由于增加了G-C含量,可提高退火温度,进一步避免引物间的结合,增加特异性[3]。Oncor公司设计RP引物代替CX引物,得到从50bp开始的6bp差异的梯带[4]。

3 扩增片断的检测

3.1 同位素法 Kim建立的方法即为同位素法,其应用最多。采用[α-32P]dGTP或dCTP掺入的报道很多,但部分学者用[γ-32P]dATP和T4激酶标记TS引物的5′端,发现更易于检出低水平的端粒酶,同时更易定量。PAGE凝胶电泳后在X-光片上放射自显影或用Phosphoimager仪扫描测定3h。同位素法的优点是灵敏度高,100个永生化细胞27个循环即可检出,缺点是存在放射性污染,且放射自显影需8h至两天以上时间,时间较长。

3.2 染色法 电泳后用SYBR green或EB染色,然后紫外灯下观察或用CCD图像系统测定。EB在302nm紫外透射仪和桔红色紫外滤光片下效果最好,可得与SYBR green相近的敏感性。染色法简便,快速,灵敏度为100个永生化细胞30个循环,由于染色带的信号强度不能精确反映其分子数(大片断染色更强),因此染色法只能判定相对端粒酶活性,而不能测定端粒酶延伸产物的确切数量。

3.3 荧光法 加入10pmol荧光素标记(如FAM,FITC)的TS和/或CX引物扩增,经8%的变性PAGE凝胶电泳,DNA测序仪自动读取数值,片断管理系统软件自动计算扫描曲线的峰高和峰面积,从上样到出结果仅需90min。荧光系统极敏感,为避免过量扩增产物可能给出不可靠结果,要使用0.5~1.0μg的低蛋白量,扩增27个循环,由于片断管理系统能自动检出很微弱的荧光,因此不能精确测定低水平端粒酶活性[8~11]。荧光法的另一应用是于原位—TRAP分析,可以在细胞水平上检出端粒酶活性,因此可以判定是哪些细胞、多少细胞具有端粒酶活性,而裂解提取法不能知其活性的细胞来源。原位分析在硅化玻片上进行,荧光显微镜下观察结果。目前只用于新鲜标本,用冻存病理标本的实验尚不成功,需改进方法防止冻融中胞内端粒酶的分散及增加标本的渗透性等。

3.4 ELISA法 TS引物5′端标以生物素,PCR扩增后,将产物变性,加入地高辛标记的可与扩增产物的重复片断特异结合的探针,杂交产物上的生物素与固定在微孔板上的卵白素相结合,而探针上的地高辛与过氧化物酶标记的抗地高辛抗体结合,然后加入底物,显色后用酶标仪测定。ELISA法是宝灵曼试剂盒使用的方法,由于没有电泳,因此观察不到6bp差异的梯带。

4 质量控制

4.1 排除假阳性 设置以下四种对照(1)85℃10min灭活端粒酶;(2)端粒酶对RN ase敏感,0.5μg/10μl提取液+1μgRNase,37℃,20min;(3)不加提取液;(4)不加CX或TS引物。以上实验可排除引物二聚体或PCR污染。

4.2 排除假阴性 (1)以阳性细胞沉淀(106细胞)的裂解提取液为阳性对照进行TRAP分析可以排除由于试剂质量不好造成的假阴性。(2)组织提取液中Taq酶抑制物的存在会造成假阴性,为此Wright等加入一个150bp的内标准。内标准的获得方法如下:设计TS加长引物:5′-AATCCGTCGAGCAGAGTTGTGAATGAGGCCTTC-3′和CX加长引物:5′-(CCCTTA)3CCCTAATAGGCGCTCAATGTA-3′,分别在TS和CX引物的3′端增加15个碱基,可与编码鼠肌蛋白的97~132位氨基酸的碱基匹配,扩增后得到150bp产物,柱纯化后备用。每个TRAP反应加入15ag内标为模 板,TS和CX引物既可扩增端粒酶延伸产物,又可扩增150bp的内标,当无150bp扩增带出现时说明存在Taq酶抑制剂,这对内标为众多学者所采用。也有其它学者采用200bp或36bp的内标[4,8,14]。(3)稀释提取液可降低酶抑制物浓度,扩增带从无到有说明含酶抑制物。为了减少甚至排除某些标本中存在的抑制物的影响,许多学者在得到端粒酶延伸产物后进行酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)抽提,酒精沉淀纯化。

5 端粒酶活性的半定量检测

由于端粒酶活性在少数正常组织细胞中有微弱的表达,而且与细胞的增殖活跃程度、肿瘤的恶变程度及预后等有关,因此半定量测定端粒酶活性在临床应用上意义重大。简便的方法是通过10倍稀释提取液以有无6bp差异的梯带产物为标准。在任何稀释度下无产物为(-);不稀释下有产物为(+);10倍稀释下有产物为(++);100倍稀释下有产物为(+++),还可再进行1000倍稀释。Wright等将内标引入后使端粒酶活性的半定量检测成为可能,将6bp差异的梯带强度总和和除以内标的强度进行标准化后,在10~11000个细胞间具有很好的线性关系,而无内标时在大于300个细胞即进入平台。许多学者采用这种方法描述相对端粒酶活性。

Oncor试剂盒(1996年第2版)提供了更为准确的方法,用Phosphoimager仪扫描测定凝胶信号,TPG(Total product Generated,总生成产物)单位=((x-x0)/c)/((r-r0)/c)×100(TSR8为0.1amol),其中x代表无热灭活处理标本管中梯带信号总和;x0代表热灭活管信号;r代表TSR8质控管梯带信号总和,TSR8是人工合成的寡核苷酸链,由于TS连接AG(GGTTAG)7构成;r0代表无标本的裂解液对照管信号;c和cR分别代表无热灭活处理标本管和TSR8质控管中内对照的信号,每个TPG单位相当于1×10-3amol或600个TS引物分子30℃,10min延伸至少4个端粒重复序列的数量,在1~300TPG(相当于约30~10000个阳性对照细胞中所含端粒酶活性)范围内成线性。

6 小结

综上所述,Kim建立的同位素法灵敏度高应用最多,但是存在放射性污染且时间较长,染色法操作简便时间短,不过只能检测相对端粒酶活性, 荧光法只用于新鲜样本,在日常的应用中大家可根据具体情况选择不同方法或对其进行简单的组合操作。

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