细胞培养菜鸟必知：入门篇

实验前准备

1. 玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒:1) 高压蒸汽灭菌 15 分钟以上;2) 干烤消毒 140 度 2 小时以上;

2. 无菌工作台先清洗后用 75% 酒精擦拭干净, 紫外线照射 40 分钟以上; 各种培养板照射 3 小时以上;

3. 培养基 (pH7.2) 和血清配制好后要做无菌试验: 将血清按 10% 加入培养基内, 用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基 5-10 ml 置培养箱内培养 2-3 天, 肉眼见无浑浊或沉淀等异物. 分装后置-20 度保存;

4. 消化液 (pH7.8) 或其它加入液, 应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌, 分装成支置-20 度保存;

5. 培养箱应先用清水清洗后用 75% 酒精擦拭一遍 (如有紫外线的应照射 1 小时以上, 如有高温灭菌的应按程序来菌). 至少每月一次.

6. 进入操作时应注意先清洗双手及手腕, 然后用 75% 酒精擦拭, 操作时注意无菌台内空间层次. 手及物品不要在暴露的瓶口上方来往, 如果数量较多, 培养瓶应放在与酒精灯平行地方便于操作, 瓶与瓶之间应相隔一定的距离, 开瓶 (盖) 时应先用 75% 酒精反复擦拭或用灯烧, 开开后应用灯先烧口, 然后烧盖. 用完后同样操作. 整个操作过程尽量在无菌台靠里面一点.

复苏:

1. 应遵守慢冻快融的原则. 先将水温锅调至 37-37.5 度, 取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化.

2. 在无菌台内将完全培养基加入 50 ml 的小培养瓶内, 约 5 ml 左右, 然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞, 置培养并内轻轻摇晃, 使细胞均匀后置培养箱内培养.

传代:

1. 贴壁细胞:

对于贴壁细胞应先吸 (倒) 尽培养基, 吸的越干净越好, 以免中和后加入的消化液, 使强度减弱.50 ml 培养瓶加入消化液约 0.6 ml, 按此比例进行消化,(根据配制强度经验), 晃动使消化液铺均匀置 37 度培养箱约 2 分钟, 镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后, 轻轻振动瓶底使细胞全部脱落, 加入 2-3 ml 完全培养基后, 轻轻吹打, 使细胞基本成单个悬浮, 然后分置其它无菌培养瓶内, 加入完全培养基后继续培养或实验.

2. 悬浮细胞:

一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内, 加入完全培养基继续培养, 如要高浓度可先离心 500rpm,5 min 后加入完全培养基, 轻轻吹匀后, 分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养.

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