基于蛋白质原料的体外诊断产品的稳定性问题

免疫诊断产品开发的基础——蛋白质，是一种生物大分子，它根据希腊神话中一位多变的艺术形象——Proteus（希腊海神）而命名。如同他们共通的名字所展示的那样，蛋白质具有改变自身构型的能力，不过这也导致了其活性的丧失。因此，例如抗体、凝集素、酶等蛋白质试剂所具有的特异性结合、催化反应功能，对在预处理、贮存、使用加工等操作过程中存在的潜在有害影响非常敏感。

本文将对关系到体外诊断产品的各种蛋白质稳定性问题进行讨论。一部分问题是关于进行干燥处理的蛋白质的稳定性，另一部分是关于保持在溶液状态的蛋白质的稳定性。

干燥、冷冻或者冻干过程可能会造成蛋白质的严重变性，除非蛋白质得到了适当的保护。因此，正确的干燥方法和保存条件对于干燥组分的保质期至关重要。而溶液状态下蛋白质的稳定性则受到众多可变因素的影响：温度、微生物污染、酸碱度或者缓冲溶液。

此外，本文还将讨论为什么产品性能的问题并不总是应当归罪到稳定性问题上。在生产过程中的因素也许才是罪魁祸首。

蛋白质的特性

蛋白质是一种具有三维空间催化反应或者特异性吸附功能的柔性分子聚合物。催化反应和特异性吸附位点上的氨基酸的空间构相是由这些氨基酸相互之间，以及溶剂、溶质分子的交互作用决定的。

蛋白质分子由亲水和疏水氨基酸组成；这样的一种组成使得蛋白质在水溶液中会自然折叠，让更多的疏水氨基酸折叠聚集在球形蛋白质内部，而让更多的极性氨基酸暴露在能与水结合的表面。

其他起到交联效果的相互作用力包括静电作用、氢键、范德华力、螯合作用以及共价键（比如：二硫键）。其中一些相互作用力对于诸如冷冻、干燥等相变产生的影响非常敏感。

干燥稳定性问题

尽管大多数可特异性吸附的蛋白质在溶液状态的自然构象下发挥作用，但干燥或者冷冻状态仍然是稳定保存的首选。在这些相对稳定的状态下，诸如蛋白酶、氧化剂等有负作用的溶剂与蛋白质的频繁碰撞将会得到最大限度的减少。但是通过干燥或者其他相变方式，比如沉淀和冷冻，将溶剂从蛋白分子中去除，将可能损害蛋白质的功能构造。这些相变可能使通常折叠在分子内部的疏水氨基酸暴露在分子表面，从而造成蛋白质分子通过疏水表面与其他分子结合，导致蛋白质分子的变性。

干燥的方式包括自然风干或者冷冻干燥，例如试剂瓶中结合物的干燥、塑料板或者膜材料上包被抗体的干燥。需要注意避免的是在一系列步骤中无意识间发生的干燥，可能是由于同时操作一大批例如平板或者试管等包被产品而引起，也有可能是由于工作在极其干燥的环境而引起。

在要干燥的溶液中加入适当的溶质来防止蛋白质变性是一种非常有效的保持蛋白质稳定的方法。这些溶质的特点是都具有亲水基团，这些基团通过掩盖疏水性氨基酸从而达到稳定蛋白质功能构造的作用。因此，由于在干燥时溶剂的去除会促进蛋白与蛋白，尤其是蛋白与固相表面的相互作用，所以在干燥前加入稳定剂非常重要。

商品化稳定剂的使用

商品化稳定剂同样适用于保质期的优化。在一个实验中，96孔聚苯乙烯板(Immulon 2; Dynex Technologies Inc.； Chantilly, VA)上包被单克隆或多克隆抗体，这些抗体分别采用以下试剂作为稳定剂：Stabilguard biomolecule stabilizer (SurModics Inc.； Eden Prairie, MN)、 Stabilcoat immunoassay stabilizer (SurModics Inc.)、Superblock blocking buffer (Pierce Chemical Co.； Rockford, IL) 以及牛血清白蛋白 (BSA)。其中使用磷酸盐缓冲液(PBS)作为阴性对照。然后将这些平板干燥并密封保存在放有干燥剂的铝箔袋中。室温保存一段时间后，单克隆抗体包被的平板被用来进行夹心法酶联免疫测定，而多克隆抗体包被的平板则进行以辣根过氧化物酶为抗原的直接吸附测定。

图1 单克隆抗体在室温下稳定性的研究

在室温下保存18月后，除了以BSA作为稳定剂的单克隆抗体外，所有单克隆抗体样本的活性回收率都在比较好的范围70-80%（见图1）；而多克隆抗体的实验结果则表现出更显著的差异（见图2）。但是，关系到稳定剂Superblock的50%活性的损失，似乎发生在干燥的过程中，而在其后的保存过程中则保持了相对稳定的活性水平。从实验可以看出多克隆抗体比单克隆抗体更加存在活性损失问题，这表明在测试多种产品时可能有必要找到针对每个体系的最适稳定剂。

图2、 多克隆抗体在室温下稳定性的研究

干燥方法的影响

无论是干燥方法还是保存条件，想要保持稳定都有很苛刻的要求。当蛋白应用到膜上时，通常要求非常快速的干燥或者冻干，以保持蛋白最佳性能和活力。而对于平板、试管或者微珠的蛋白包被来说，相对于快速干燥，确保组分的彻底干燥则更为重要。为了得到最大限度的有效期，所有干燥后的产品都需要保存在放有干燥剂的密闭容器中。

我们研究了不同干燥方法对抗体在室温下保存6到12个月后活性的影响，最后得到下列数据（见图3）。在这个实验中，为了比较不同干燥方法的影响，在96孔板中加入抗兔单克隆抗体并进行孵育，然后洗板，接着在同一块板的不同位置分别加入Stabilguard biomolecule stabilizer 和Superblock blocking buffer，孵育后吸除。最后这些96孔板通过下列常用的方法进行干燥：

• 室温(20–24°C)下，相对湿度为16%的烘房中干燥4小时。

• 室温(20–24°C)下，装有干燥剂的密封塑料袋（相对湿度为23%）中放置4小时。

• 37°C 下，相对湿度为26%的烘箱中烘干2小时。

作为负对照，在室温下，将一些板放入不含干燥剂的潮湿的铝箔袋中，密封保存90分钟。

这些经过干燥的平板接着被密封

图3 抗兔单克隆抗体活性保留的百分比；这些抗体均经过Stabilguard 或者Superblock 处理，并分别采用4种不同方式进行干燥（包括一个未干燥处理的负对照），最后在室温下保存6到12个月。

在放有干燥剂的铝箔袋中并在室温下保存，以便对长时间的稳定性进行评估。抗体活性的回收率通过酶联免疫夹心法检测得到，其中兔源抗体作为待检物，HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗兔作为夹心法中的第二抗体。在检测的时候，新近包被一批平板（即不进行干燥处理）作为标准对照或者100%活性值对照。

虽然这几种干燥方法并不是截然不同，但使用烘房的干燥方法总是表现出最好的结果。而对于长时间保存在不含干燥剂的铝箔袋中的那些负对照平板，则很容易观察到活性的明显丢失。

溶液状态的稳定性问题

虽然抗体、酶以及其他诊断用蛋白在水溶液中处于天然的机能状态，但这并不是它们最稳定的状态。在溶液中，有众多的因素影响着蛋白的活性功能：

• 蛋白质分子变得更加柔韧易折，从而倾向于改变构象。

• 蛋白质分子和其他分子以及容器壁的碰撞频率增加了。

• 微生物污染的可能性增加了。

• 对温度升高和蛋白浓度降低造成的影响更加敏感。

• 蛋白质更易被氧化。

通常来说，溶解的蛋白质分子在较低的温度和较高的蛋白浓度下最为稳定。在刚好高于冰点的时候，蛋白质分子拥有较少的动能，而这些动能是蛋白质“摆脱”其能量最低的功能构造所必需的。（前面的表述可能不是很好理解，解释如下：蛋白质的自然折叠结构是自由能最低的构象，若要改变蛋白质的构象，比如蛋白变性，则需要能量来实现；因此蛋白在低温下能量较低，也就不容易变性。）在溶液中，部分蛋白活性的损失是由容器壁的吸附、寡聚酶的解聚以及氧化剂、水解酶、微生物等痕量污染物对蛋白质的灭活等原因造成的，而在越高的蛋白浓度下（毫克每毫升范围或更高），损失的蛋白活性占蛋白总活性的比例也就越低。

正确的PH值的重要性

图4 pH值对稳定性的影响。进行试验的溶液包括HEPES (a)、citrate (b)、MOPS (c)、 glycine (d)、Tris (e)和saline (f)，并都与Stabilzyme Select conjugate stabilizer按1:1混匀，然后保存在37°C.每一条曲线图表示受测试溶液相对于保存在4°C的对照溶液所保留的活性百分比。

蛋白质分子的带电基团通过静电或者螯合键进行相互作用，从而使蛋白的功能构造稳定。7.8众所周知，催化

酶对PH值或者氢离子浓度很敏感，这也使得几乎所有使用的缓冲液都要求维持酶溶液所需要的PH值。也许受到较少广泛关注的是酶对缓冲离子化学性质的敏感性。

以下数据来自一项对酶-抗体复合物的稳定性研究，其中复合物溶解在具有不同pH值的缓冲液和盐溶液中，另外溶液中还含有Stabilzyme Select conjugate stabilizer (SurModics Inc.)。这些数据通过酶联免疫直接测定法得到，即将羊抗兔抗体-辣根过氧化物酶偶联物用于检测新近包被兔源抗体的平板上。

试验中测试了5种pH值。虽然其中一些pH值明显超出某种特定缓冲液的缓冲范围，但仍纳入了不同缓冲液在这些pH值下的影响结果进行直接对比。受测试的5种缓冲液是：

• 柠檬酸盐

• 甘氨酸

• N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES)

• 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS)

• Trizma Base (tris[hydroxymethyl]-aminomethane) (Tris)。

第六种受测溶液为生理盐水。

这些缓冲液浓度均配制为0.1M，每种分成5份，调节得到5个不同的pH值。然后这些缓冲液和生理盐水分别与另外准备好的无缓冲能力的Stabilzyme Select 溶液按照1：1混合。再测一次pH值，若有变动则调回所需值。接着酶-抗体复合物用上述溶液按1：20000稀释后分别在4°C和37°C保存。

在测试酶联免疫测定的活性前，先将上述溶液平衡到室温。在每个测试时间点都要对pH值进行测定。虽然大多数溶液会保持在原始pH值的0.2个单位浮动范围内；但在37°C ，当柠檬酸盐溶液、甘氨酸溶液和生理盐水的原始pH值高于7.0，它们的pH值会随着时间迅速降低。在实验结果中，在37°C保存的酶-抗体复合物最后保留的活性表示为对应的4°C保存的酶-抗体复合物保留活性的百分比。(见图4)。

实验结果显示，抗体-辣根过氧化物酶的活性回收率无论是在不同缓冲离子的溶液中，还是在每种溶液的不同pH值中，均有显著不同。HEPES 仅仅在所有测试的pH值中最低的6.0时才起到有效的稳定作用，而柠檬酸盐在任何pH值时都无效。然而，柠檬酸盐的效果与pH值的关系并不大，也许造成其稳定作用微弱的原因是它会通过螯合作用竞争结合蛋白复合物稳定所需要的多价阳离子。虽然不是在所有的pH值水平，但其他的溶液有效地稳定了复合物的活性，使其在30天后的活性回收率达到75%甚至更高。

MOPS在pH值6到7之间具有最好的活性保持效果。甘氨酸、Tris和生理盐水在pH值6到7.7之间具有最好的活性保持效果。意想不到的是，生理盐水混合Stabilzyme Select 后具有的稳定效果和其他缓冲液在pH值6到7.7之间时的稳定效果一样，甚至在pH值8.5时效果更好。这项研究证明，对于一个检测体系而言，选择最适缓冲液和最适pH值同样重要。

稳定性问题的其他因素

蛋白来源、纯化方式以及化学偶联的方法都能影响蛋白试剂的活性和稳定性。例如，碱性磷酸酶的来源就对复合物的稳定性有重大影响；就溶液的稳定保存而言，将所需蛋白与对蛋白有伤害作用的酶（如水解酶、氧化酶）从原料中分离是非常重要的；若要保证溶液稳定，就必须去除或者灭活这些有害酶以及能产生这些酶的微生物。

在合成复合物时，大量的化学反应步骤已被证明能使酶和抗体分子之间形成共价键。其中的一些方法对某些酶-抗体复合物的稳定负面影响较低。如果一种酶联复合物丧失了酶联检测的活性但仍保持有酶活力，那么另外选择一种化学偶联方法也许能解决这个稳定性问题。

其他操作问题

有时候，被认为是稳定性方面的问题实际上是由其他变数造成的蛋白量不足。也许就是一个很明显的稀释错误。生产商必须弃用那些有可能吸收蛋白或者抑制蛋白活性的容器材料，例如未处理的聚苯乙烯、聚砜、聚碳酸酯或者玻璃。聚乙烯和聚丙烯是比较可取的容器材料。有色酶和其他含有氧化金属离子的蛋白溶液不能暴露在阳光下。在保存和酶检测反应阶段温度控制不好很容易引起变化。在酶活力测量阶段，定时上的疏忽也是一个影响因素。此外，就如之前提到的那样，在每一步操作步骤之间，若使包被的孔、试管或者微球变干，也会产生变数。

结论

在免疫诊断所用的原料中，主要部分都是抗体、酶、水溶性蛋白。为了保证诊断检测的有效期和精确性，这些原料蛋白必须保持稳定和有效。

除非蛋白得到适当的保护，否则干燥过程有可能使蛋白发生严重的变性。包被有蛋白的部件的干燥和保存方式同样非常重要。保存在密封、干燥的环境将有助于确保长时间的稳定。

而保存在溶液状态，潜在的危害因素将会增多。比如很简单的一个方面，pH值或者缓冲溶液的改变就能够使蛋白在溶液中的稳定性明显不同。

使某种溶液状态稳定的方法并不一定就对另一种溶液有效。商品化的可用的稳定剂专注于特别的稳定效果，因此测试大量的稳定剂产品或许就能找到针对某种需要的非常有效的稳定剂。

在生产过程中的其他因素也有可能影响产品的性能。这些因素包括原料来源、稀释和定时错误、温湿度不合适、曝光和容器材料等。最后，一个看似最基本的因素，当使用商品化的稳定剂时，一定要确保符合包装说明。

参考文献

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Patrick E. Guire博士是SurModics公司(Eden Prairie, MN)的首席副总裁、首席科学官员和创始人之一。

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