植物病原物的分离、培养与接种

一、 目的和要求

要求学会植物病原真菌、细菌、病毒和线虫的分离、培养和接种的一般方法，并掌握其基本原理；学习植物传染性病害研究中常用的接种方法，比较不同接种方法对病害发生发展过程与外界环境的差异。

二、材料和用具

新鲜的真菌和细菌病害材料（辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病叶片、水稻白叶枯病叶、烟草花叶病和番茄根结线虫病等）；番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗、水稻白叶枯病菌/稻苗、烟草花叶病/烟草
喷雾器、纱布、酒精灯、酒精缸、火柴、接种饵（针）、长镊子、玻棒、小木块、解剖刀、刀片、载玻片、蒸馏水（滴瓶）、漂白粉精片两研缸、漏斗、皱纹纸、毛笔、针、剪刀、三角瓶、试管、记号笔、标签、金刚砂、保湿罩、弥雾机。70％乙醇、0．1％升汞、灭菌培养皿（吸管）、灭菌水、灭菌培养基（PDA和NA）。

三、内容与方法

3．1 病原真菌的分离和培养 植物病原微生物分离和培养工作应该在专门的无菌操作室或超净工作台上进行，但是亦可在清洁和安静的房间中进行。工作时在桌面上铺一块沾湿的纱布，所有工作用具放在湿纱布上，尽量少在室内走动，减少空气流动，以减少污染。选用的分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生物处于较为活动的状态，生长快，易分离成功。

植物病原真菌的分离有组织分离法和稀释分离法两种，在病组织上产生大量孢子的病原真菌以及病原细菌的分离都可用稀释分离法。

3．1．1 组织分离法 按照以下步骤进行：

（1）培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注明分离日期、材料和分离人姓名。
（2）培养皿平板制备：用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1－2滴（减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼胶培养基一管倒入培养皿中，轻轻摇动使成平面（分离细菌时则不能加乳酸）。
（3）切取病组织小块（叶斑病类）：取新鲜病叶，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘切取小块（每边长约3―5毫米）病组织数块。
（4）表面消毒：将病组织小块放入70％酒精中浸数秒钟后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中消毒1―3分钟，然后放入灭菌水中连续漂洗三次。也可用漂白粉精片（1－2片），研磨后加灭菌水10ml，消毒5―10分钟。果实、块茎和枝秆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70％酒精涂拭病部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行2－3次，达到表面消毒。
（5）用无菌操作法将病组织小块移至培养基平面上，每培养皿内可放4－5块。
（6）翻转培养皿，放入26－28℃恒温箱内培养，3―4日后观察结果。
（7）用无菌操作法自培养皿中选择菌落，挑取少许菌丝及孢子，在显微镜下观察。如系玉米小斑病菌孢子，即可用接种针自菌落边缘挑取小块菌落移入斜面培养基，在26－28℃恒温箱内培养，3－4天后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得玉米小斑病菌纯菌种，可置于冰箱中保存。如有杂菌生长，需再次分离获纯培养后，方可移入斜面保存。

3．1．2 稀释分离法

以棉花红腐病果为材料，按照下列步骤分离：

（1）取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，分别编号（1 、2、3），并注明日期、分离材料及分离者姓名。
（2）用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一培养皿中分别注入0．5－1．0ml灭菌水。
（3）用灭菌接种饵从棉花红腐病果上刮取病菌孢子，放入培养皿内的水滴中，配成孢子悬浮液。
（4）用接种饵蘸一饵孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三饵孢子悬浮液到第二个培养皿中，混合后再移三饵孢子悬浮液到第三个培养皿中。每次移菌前，接种饵均需在酒精灯火焰上烧过。 ˇ
（5）将三管熔化并冷却到45℃左右的培养基，分别倒在三个培养皿中，摇动使培养基与稀释的菌液充分混匀，平置冷却凝固。
（6）将培养皿翻转后放入恒温箱（26－28℃）中培养，3－4天后观察菌落生长情况。
（7）获纯培养后，从菌落边缘挑取菌丝块移入斜面培养3-4天后，放入冰箱保存。
要获得纯净培养，一般需经3次稀释分离（重复3次），当培养物高度一致时才能作为纯培养的菌种保存。

3．1．3 真菌的培养

植物病原真菌多为好气性真菌，在有丰富营养的培养基上能很好地生长，但它们对温度的要求差异较大，绝大多数的真菌可以在20－30℃间正常生长，但少数要在15－20℃间才能正常生长，少数真菌孢子必须在5℃左右的低温下才能萌发。

3．2 病原细菌的分离与培养

病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病材料作细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离（少数病例无喷菌现象）。

喷菌现象

3．2．1 稀释分离法

稀释分离法是最经典的标准分离法，方法与真菌孢子稀释分离法基本相同，但要将病组织放在灭菌水中用灭菌玻棒研碎并让组织碎块在水中浸泡30－60分钟（在灭菌培养皿中研碎并浸泡），让细菌充分释放到灭菌水中成为细菌悬浮液再进行稀释分离。
3．2．2 划线分离法

除去上述稀释分离法以外，较为方便的方法是划线分离法，步骤如下：

（1）预先把NA培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中4－6小时，使表面没有水滴凝结。
（2）配制细菌悬浮液。
（3）在培养皿盖上写上分离材料名称、日期和姓名。
用灭菌的接种饵蘸取细菌悬浮液在干燥的培养基平板表面按图17所示方法划线。划过第一次线后的接种环应放在火焰上烧过，冷却后直接在第一次划线的末端向另一方向划线，同上，灭菌后再划第三、第四次线。
（4）翻转培养皿，放在26－28℃恒温箱中培养，2－3天后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来（C）。
（5）仔细挑取细菌的单菌落移至试管斜面，同时再用灭菌水把单菌落细菌稀释成悬浮液作第二次划线分离。如两次划线分离所得菌落形态特征都一致，并与典型菌落特征相符，即表明已获得纯培养，最好要经过连续三次单菌落的分离。确保纯化。

3．2．3细菌的培养

病原细菌的培养条件因种类不同而略异。棒杆菌属细菌的生长适温较低（20－23℃）；假单胞菌中的青枯菌类则要求在较高的温度（35℃）下才能良好地发育；软腐型欧氏杆菌在厌氧条件下生长比好气条件下生长更快，致病力更强。

3．3植物病毒分离和纯化

植物病毒的分离和纯化比较特殊，由于病毒是专性寄生物，因此不能离开活的寄主。操作时虽然不需无菌操作，但仍必须实行严格的隔离以防止污染和混杂。 ′
以有花叶病症状的烟草病叶为材料，进行病毒的“单斑分离”与纯化，步骤如下：
（1）首先用肥皂水洗净双手，特别注意刷去指甲内的污染物。
（2）采摘半片病叶放在消过毒的研钵中，加磷酸缓冲液（0.01M PBS，pH7．2）
1ml（5－6滴），研碎。
（3）在供接种用的心叶烟幼苗和苋色藜幼苗健苗顶部平展叶片上，撒少许金刚砂（600目／英寸2），然后用手指蘸取病汁液轻轻涂抹叶片（摩擦接种），写好标签牌，插在盆钵中。
（4）3分钟后用自来水将接种叶冲洗干净，放在温室中培养。
（5）2-3天后在接种叶上即出现坏死性枯斑，初为褪绿，后为黄白色。
（6）剪下单个枯斑，再按上述方法接种健康的心叶烟和苋色藜幼苗，使它再次出现形状大小、色泽均一致的枯斑，即为已经分离纯化的病毒标样。材料经快速干燥后可置低温下保存。
（7）将此枯斑病叶分别接种到黄瓜或普通烟草上，又可得到系统的花叶症状。不同的病毒接种在不同的寄主植物上会变现不同的症状。选用这些特定寄主植物作为鉴别寄主，进行病毒和病毒病害的诊断，可做出初步鉴定。将病组织汁液接种在枯斑寄主上，根据枯斑的特征，还可进一步区分病毒的种类，并作为病毒定量的一种简易方法。

3．4 植物病原线虫的分离

大部分植物寄生线虫只为害根部，有些还是根内寄生的，少数可为害地上茎、叶、花果。从有病植物材料中和土壤中分离线虫的方法很多，它们各有优缺点，常用的方法有漏斗分离法、浅盘分离法、漂浮分离法等。

3．4．1 贝曼（Baermann）漏斗分离法

操作简单、方便，适于分离植物材料和土壤中较为活跃的线虫。一般是选用一只口径为10－15cm塑料漏斗，下接一段长约5－10crn带有弹簧夹的乳胶管，漏斗放在木架或铁环上，漏斗内盛满清水，病植物材料或土样用双层纱布包扎好，慢慢浸入清水中，浸泡24小时后样品中线虫因喜水而从材料中游到水中，并因自身重量逐渐沉落到漏斗底部的橡皮管中，慢慢放出5ml管中水祥于离心管中，在1500转／分的离心机中离心3分钟，倾去上层水液，将底部沉淀物连同线虫一起倒在表面皿或计数皿中，在解剖镜下计数，然后将线虫挑至装有固定液的小玻管中备用。样品材料也可用一网筛搁在漏斗口上，使水面能淹没材料，线虫也可以游离出来并沉降到底部。

3．4．2 浅盘分离法 用两只不锈钢浅套放在一起，上面一只称筛盘，它的底部是筛网（10目／英寸2），下面一只浅盘略大些是盛水盘（底盘）。

将特制的线虫滤纸放在筛盘中用水淋湿，上面再放一层餐巾纸，供分离的土样或材料放在餐巾纸上，在两盘之间隙缝中加水浸没材料，在室温（20℃以上）下保持8天，材料中的线虫大都能穿过滤纸而进入托盘水中，收集浅盘中的水样通过二个小筛子（上层为25目粗筛，下层为400目细筛）。线虫大多集中在下层筛上，可用小水流冲洗到计数皿中。
浅盘法比漏斗法好，它可以分离到较多的活虫，而且泥沙等杂物较少。

3．4．3 胞囊漂浮器分离法（Fenwick－Oostenbrink改良漂浮法）

对于没有活动能力的线虫胞囊可采用Fenwick漂浮筒漂浮的方法分离，筒内先盛满清水，把10.0g风干土样放在顶筛中。用强水流冲洗土样，使全部淋入筒内，再用细水流从顶筛加入，使土粒等杂物沉入筒底，胞囊和草渣等则逐渐漂浮起来沿倚口倾斜的环槽流到承接筛中（100目）,先把筛中胞囊等沈入烧杯中，再倒入铺有滤纸的漏斗中，收集滤纸上的胞褒。
在解剖镜或扩大镜下，学习用镊子、毛针、竹针、毛笔等工具从水样或滤纸上挑取线虫。

3.5 拌种法和浸种法 种子传染的病害可采用这两种接种方法。拌种法是将病菌的悬浮液或孢子粉拌和在植物种子上，然后播种诱发病害。小麦腥黑穗病可采用此法接种。浸种法是用孢子或细菌悬浮液浸种后播种，大麦坚黑穗病、棉花炭疽病和菜豆疫病可用此法接种。

3.6 土壤接种法 由粪肥、土壤传染的病害可以采用拌土接种法。土壤接种法是将人工培养的病菌或将带菌的植物粉碎，在播种前或播种时施于土壤中，然后播种。也可先开沟，沟底撒－层病残体或菌液，将种子播在病残体上，再盖土。
有的病原物能在土壤中长期存活（土壤习居菌），把带菌土攘或带有线虫接种体的土样接种到无菌（虫）土中，再栽种植物，就可以使植物感染，如棉花枯黄萎病、小麦土传花叶病毒和一些线虫病等。对于青枯菌可以采用土壤灌根的方法。

3．7喷雾法和喷撒法 这两种方法适用于气流和雨水传染的病害，大部分细菌病害和真菌叶部病都可采用喷雾接种，如水稻细菌性条斑病、玉米大斑病、小斑病。将接种用的病菌配成一定浓度的悬浮液，用喷雾器喷洒在待接种的植物体上，在一定的温度下保湿24小时，诱发病害。

3．8伤口接种 除了植物病毒接种时常用的摩擦接种属伤口接种之外，植物病原细菌、病原真菌也常用伤口接种法。许多由伤口侵入，导致果实、块根、块茎等腐烂的病害均可采用。先将接种用的瓜果等洗净，用70％酒精表面消毒，再用灭菌的接种针或灭菌的小刀刺伤或切伤接种植物，滴上病菌悬浮液或塞入菌丝块，用湿脱脂棉覆盖接种处保湿。
水稻白叶枯病的伤口接种常用剪叶接种和针刺接种法。先通过火焰或用75％酒精消毒解剖剪，将剪刀在白叶枯病菌悬浮液中浸一下，使剪刀的刃口蘸满菌液，再将要接种的稻叶叶尖剪去。接种处不必保湿，定期观察病情。细菌悬浮液的浓度为108cfu／ml。

3．9 介体接种

3．9．1 菟丝子接种 在温室中研究病毒、菌原体等病害广为采用的一种接种方法，先让菟丝子侵染病株，待建立寄生关系或进一步伸长以后，再让病株上的菟丝子侵染健株，使病害通过菟丝子接种传播到健康植株上。

3．9．2 蚜虫及其他介体昆虫接种 详见植物病毒的传染方法。

所有的接种实验都应设有对照，即用清水代替病菌，用同样的方法接种，观察发病与否。
分别用土壤灌根法接种番茄青枯菌、用喷雾接种法接种水稻稻瘟病菌、用剪叶接种的方法接种水稻白叶枯病菌，注意针对不同病害接种后培养的条件，观察不同病害症状出现的过程。

四、 作业与思考题

（1）以小组为单位进行接种，每一组做一套，每人每天自己负责观察记载。
（2）用所给的新鲜病害材料，进行真菌和细菌病原菌的分离和纯化，观察并记载分离物的培养性状。
（3）用分离到的病毒标样接种1－2个鉴别寄主，并记载寄主反应类型。
（4）为什么要分离并纯化病原物？
（5）是否所有的病害都能分离到病原物？为什么？
（6）接种的目的是什么？ ｜
（7）接种后的植株应怎样培养？
（8）如果只有一个喷雾器，应先接病菌还是先接对照（水）？为什么？

五、实验时间 　

4天