干货：腺相关病毒（AAV）技术快速入门手册

腺相关病毒（AAV）作为一种安全、持久、高效、高特异性的基因操作工具，在生物学特别是神经生物学领域中被广泛使用。许多新手对于 AAV 的使用往往是知其然而不知其所以然。这篇短文将以图文结合的形式争取让大家在最短的时间内全面了解这种病毒工具。

什么是 AAV？
野生型 AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。而我们做实验用的是不需要辅助病毒的重组 AAV 病毒（rAAV）。将目的基因的 CDS 区序列或者 RNAi 干扰序列插入 rAAV 表达质粒中，包装病毒，然后直接使用 rAAV 感染细胞就能完成目的基因操作。

什么时候用 rAAV？
当我们需要对特定基因进行过表达或干扰时，特别是做动物实验的时候，就可以使用 rAAV 病毒。针对不同的实验需求，下表可以帮助您选择合适的病毒工具

rAAV 的优点是什么？
1. 安全性高，目前还没有发现 AAV 对人体致病；每 10 个人中就有 8 个人在一生中会感染 AAV，而 rAAV 更是去除了 96% 的 AAV 基因组，进一步确保了安全性。目前唯一通过欧盟药监局的基因治疗药物 Glybera 也是一种 rAAV。

2. 免疫原性低：当 AAV 用局部大剂量感染肌肉、脑、眼等组织时，很少有感染上的细胞之后被免疫系统所清除。这种特性对于动物实验上显然极有帮助。

3. 感染谱广：几乎所有处于分裂期和静止期的细胞都可以使用 AAV 来感染。

4. 表达时间长：rAAV 可在宿主细胞中形成附加体（episome）存在于细胞核中，在细胞分裂不旺盛的组织中可持续表达 5 个月以上。

5. 扩散性强：rAAV 具有远高于腺病毒和慢病毒的扩散性，可以穿透血脑屏障，是最理想的神经元和胶质细胞感染工具。

6. 高稳定性：rAAV 病毒可使用冰袋运输，并且对氯仿等试剂具有抗性。

7. 特异性强：rAAV 有十数种常用的血清型，不同的血清型对不同的脏器有较高的识别及感染能力。

rAAV 的局限性有哪些？
1. 体外实验表达水平较低：主要是因为 rAAV 病毒的基因组是单链 DNA，在体外环境形成双链并转录翻译外源基因的效率非常低。可以在体外水平感染 rAAV 病毒的同时感染辅助病毒比如 Ad5 型腺病毒或者终浓度 10~50 mM 的丁酸钠等方法提高细胞实验的 rAAV 表达量。

2. 需较长时间开始表达：同样是需要从单链 DNA 变成双链 DNA，rAAV 在感染后需要较长的时间来表达外源基因，所以 rAAV 感染后建议至少 1 周后做切片观察。

怎么选择合适的 rAAV 血清型？
目前文献中使用最多的 rAAV 血清型包括 2,5,8,9。这几种血清型基本涵盖了所有组织和脏器的特异性感染，吉凯基因也可以提供这些常用血清型的 rAAV 改造和包装服务。下图是常用血清型所对应的组织脏器总结：

怎样实现器官/细胞特异的表达？
很多时候我们需要在特定的器官/细胞中表达外源序列而不影响其他脏器，这时我们有以下几种策略：
1. 局部注射，顾名思义就是直接在想表达的地方注射 rAAV 就可以了，适合器官水平特异感染，容易操作。
2. 使用组织/器官特异启动子来表达外源基因包装 rAAV，此类 rAAV 即使感染了其他组织也由于特异性启动子而不会在其他组织中表达。
3.Cre-on，Flex，DIO，double floxed 这些技术名称经常在文献中被提及，其实都是一回事，就是使用 Cre-Loxp 系统，经过两次染色体重组在特定脏器中表达外源基因。前提是我们需要获得特定的 Cre 小鼠后才可以使用这个技术。Cre-on 系统的技术原理如下：

吉凯基因可以提供适合各种器官/细胞特异表达的 rAAV 工具满足实验需求。

体内使用 rAAV 的操作注意点有哪些？
1. 小鼠的操作通过尾静脉注射的 rAAV 量推荐在 10E11~12v.g 数量级，体积推荐在 100~200ul；针对脑部的感染建议用量参考下表：

2. 在实验过程中稀释病毒产品的等渗溶液没有其他特殊要求，常规的动物试验用等渗溶液即可，如 PBS、生理盐水等。

体外使用 rAAV 的操作注意点有哪些？
1. 胰酶会破坏细胞表面的 rAAV 病毒受体，因此需要在胰酶消化 12 h 后再进行 rAAV 感染操作。
2. 如感觉 rAAV 感染效果不佳，可尝试去除血清。
3.rAAV 与细胞的吸附过程非常迅速，需要实现混匀后再处理细胞，不然会出现局部未被感染的情况。
4.rAAV 感染不需要添加慢病毒助感染试剂诸如 polybrene 等。

用完后怎么处理？
对 AAV 最有效的消毒剂是新鲜配制的 1% 次氯酸钠溶液：
1. 配制时，将 84 消毒液原液加水稀释
2. 浸泡 15 min 以达到消毒目的
3. 可以用它处理可回收的物品如玻璃器皿或是污染废液（终浓度是 1%），但如果是不锈钢器物切不可直接擦拭，否则会引起表面腐蚀。

其他的处理方式包括用 2% 戊二醛溶液或是 0.25% SDS 溶液，还可以 121℃ 高温消毒 1 小时。

本文列举了一些常见的 rAAV 问题，如有在具体实验中遇到其他问题也欢迎联系当地吉凯基因