DNA抽提标准化操作规程
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1 目的 :DNA 抽提标准化操作规范适用于HLA试验中的DNA 抽提操作。
2 适用范围 :DNA 抽提实验室
3 依据 : DNA 抽提标准化操作规范
4 引用文件 :德国BAG公司(以下简称BAG)《Instructions for use EXTRA-GENE I》
5 程序
5.1试剂准备
5.1.1 BAG® EXTRA-GENE I
该试剂盒包括3部分:Solution 1 、Solution 2、Solution 3
使用前,若Solution 2有沉淀请将其在37℃孵育,直至沉淀完全溶解
5.1.2 乙醇溶液,浓度(V/V)为96%或100%
5.1.3 乙醇溶液,浓度(V/V)为70%
5.1.4 灭菌蒸馏水,按照灭菌蒸馏水配制标准操作规范
5.2仪器及用具准备
5.2.1 移液器,规格:20µl � 200µl、200µl � 1000µl
5.2.2 移液器配套吸头,规格:200µl和1000µl,灭菌、无DNA /RNA 残留
5.2.3 Eppendorf离心管,规格:1.5ml 或2.0 ml ,灭菌
5.2.4 混匀器
5.2.5 离心机(至少13,000 rpm,)
5.2.6 水浴箱
5.2.7 DNA 浓度测定仪(DNA 单位为ng/µl,可提供A260/280)
5.2.8 试管架(每排24孔)
5.2.9 手套规格:乳胶手套,与操作者手形相适应,经灭菌
5.3操作步骤:
5.3.1 换工作服、戴手套
5.3.1.1 从工作服衣柜中换取专用工作服,戴上适应自己手形的乳胶手套。
5.3.2 血样检查
5.3.2.1 血样应在-20℃保存,保存时间不应超过1年,无溶血、血样保存容器无破裂、无渗漏、容器盖子无松动等现象。
5.3.2.2 核对血样记录与捐献者记录,确定血样是否有效,只有有效捐献者记录的血样才能用于试验。
5.3.2.3 血样量至少1 ml。
5.3.2.4 选取满足以上要求的24个血样作为一组抽提标本。
5.3.2.5 若血样本是冻存的,请将血样在室温下孵育至其完全解冻。
5.3.3 DNA 抽提
5.3.3.1 将选取的24个血样按照编号的顺序依次放置在试管架上,每排12个,共2排。在记录本上按顺序记录样品号、抽提日期、抽提者等。
5.3.3.2 取24个1.5mlEppendorf离心管,依次放置在试管架上,每排12个,共2排,与血样一一对应,并在离心管上用油性记号笔标上对应血样的号码。
5.3.3.3 向每个离心管中加入500µl--600µlEDTA或柠檬酸抗凝血(新鲜或冻存),要求抗凝血充分混匀,不见固体悬浮物。用加样器反复吹吸血液,注意吸取血液时要求缓缓吸入,不要过快,以免血液进入加样器中,污染加样器。取900µl Solution 1加入到每管中,盖紧离心管盖子(要防止手套污染盖子内壁),充分混匀混合液,不见固体悬浮物。8000rpm 离心1分钟,从离心机中取出离心管,依血样顺序放置离心管于试管架上。
5.3.3.4 小心倒去上清液,弃之,注意不要将沉淀倒出,离心管口向下倒置在吸水纸上5秒钟,使剩余液体流出。
5.3.5 向每管中加入1000µl Solution 1,振荡混匀,使细胞沉淀打散悬浮,放置1―2分钟。8000rpm 离心1 分钟。小心倒去上清液,如同5.3.3.。
5.3.3.6 此时管中沉淀应为灰白色,如果细胞沉淀仍为红色,需重复5.3.3.5 。
5.3.3.7 每管加入240µl蒸馏水,振荡混匀,务必使细胞沉淀完全打散悬浮;再加入120µl Solution 2,用混匀器充分混匀,直至沉淀完全溶解。每管加入120µl Solution 3,反复颠倒离心管,室温下孵育5--10分钟(可以适当延长孵育时间),孵育时偶尔摇匀反应管,直至产生白色絮状。13000rpm离心5分钟,重新取24个1.5ml离心管,并依次标上对应的血样号码,依次放置在试管架上。
5.3.3.8 小心将含有可溶性DNA 的上清液转倒入对应样本号的空离心管中,不要搅动沉淀; 每管再加入120µl Solution 3,反复颠倒离心管,室温下孵育5-10分钟,13000rpm离心5分钟。
5.3.3.9 重新取24个1.5ml离心管,并依次标上对应的样本号码,依次放置在试管架上。小心将含有可溶性DNA 的上清液转倒入对应样本号的空离心管中,不要搅动沉淀。
5.3.3.10 向每管加入1ml 96%乙醇,轻轻上下翻转离心管以混合均匀,室温放置5分钟,可见到白色絮状DNA 沉淀。13000rpm 离心2分钟。
5.3.3.11 小心弃去上清液,注意不要倒掉DNA 沉淀,将离心管口向下倒置在吸附物上,使剩余乙醇流出。再向每管中加入1ml 70%乙醇,反复倒置离心管。13000离心2分钟。
5.3.3.12 小心弃去上清液,注意不要倒掉DNA 沉淀。
5.3.3.13 沉淀物为白色,打开反应管,放置10分钟,挥发残留的乙醇,干燥DNA ;或者用一次性的灭菌棉签吸干反应管中的乙醇,注意不要把白色沉淀带出。
5.3.3.14 每管加入300μl 蒸馏水,在56℃孵育10分钟。
5.3.4 DNA 浓度的测定
5.3.4.1 打开DNA 浓度测定仪开关,仪器自检通过。
5.3.4.2 具体测量步骤参见各型号仪器说明书。
5.3.4.3 在样本DNA 浓度记录单上记录日期、样品号码、浓度和A260/A280等信息。浓度测定过程中要求不同样品间更换枪头,防止交叉污染。如果A260/A280>2 表示有RNA 的污染;如果A260/A280<1.6 则表示有蛋白质的存在。要求A260/A280在1.6―2.0之间。浓度要求在10ng/μl以上才可进行扩增。
5.3.4.4 测完所有样品后,将DNA 浓度记录单的样本号与对应的装有DNA 的离心管上的样本号进行核对,保证无误后,放入冷藏冰箱或扩增。
5.3.4.5 将比色皿重复5.3.4.2操作后,放入保存液中保存。关上DNA 浓度测定仪开关,盖上防尘套。
5.3.5 DNA 抽提记录的复核
应该有2人检查血样记录、装有DNA 离心管上样本号和DNA 浓度记录单上样本号,核对其一致性,有问题应该立即查找问题原因。
5.3.6 DNA 的贮存:贮存于-20℃,注意盖紧离心管盖子
5.3.7 血样的归还: 归还已经抽提后的血样。