细菌学诊断新技术(一)

随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，新的细菌诊断技术和方法已广泛用于食品微生物的鉴别。传统的细菌分离、培养及生化反应，已远远不能满足对各种病原微生物的诊断以及流行病学的研究。近年来国内外学者不断努力，已创建不少快速、简便、特异、敏感、低耗且适用的细菌学诊断方法，尤其是DNA探针和多聚酶链反应技术的发展和应用，明显提高了细菌的诊断水平。

一、快速酶触反应及细菌代谢产物的检测

快速酶触反应是根据细菌在其生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，按酶的特性，选用相应的底物和指示剂，将他们配制在相关的培养基中。根据细菌反应后出现的明显的颜色变化，确定待分离的可疑菌株，反应的测定结果有助于细菌的快速诊断。这种技术将传统的细菌分离与生化反应有机的结合起来，并使得检测结果直观，正成为今后微生物检测发展的一个主要发展方向。Rosa等将样本直接接种于Granda培养基，经18小时培养后，B群链球菌呈红色菌落且可抑制其他菌的生长。

Delise等新合成一种羟基吲哚-β-D葡萄糖甘酸（IBDG），在β-D葡萄糖苷酶的作用下，生成不溶性的蓝，将一定量的IBDG加入到麦康盖培养基琼脂中制成MAC-IBDG平板，35℃培养18小时，出现深蓝色菌落者为大肠埃希氏阳性菌株。其色彩独特，且靛蓝不易扩散，易与乳糖发酵菌株区别。

二、免疫学方法检测细菌抗原或抗体的技术

在细菌诊断中利用免疫学的各种方法日益受到人们的极大关注，从而简化了病原微生物的鉴定手续。

1. 抗血清凝集技术

早在1933年，Lancefield就成功地用多价血清对链球菌进行了血清分型。随着抗体制备技术的进一步完善，尤其是单克隆抗体的制备，明显提高了细菌凝集实验的特异性，今天广泛用于细菌的分型和鉴定，如沙门氏菌、霍乱弧菌等。

2. 乳胶凝集实验

将特异性的抗体包被在乳胶颗粒上，通过抗体与相应的细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应。通常此法需获得细菌纯培养物，再将培养物与致敏乳胶反应。业已用于鉴定大肠杆菌O157;H7

3. 荧光抗体检测技术

用于快速检测细菌的荧光抗体技术主要有直接法和间接法。直接法是在检测样品上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知的细菌特异性抗体，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的第二抗体。如研制成的抗沙门氏菌荧光抗体，用于750份食品样品的检测，结果表明与常规培养法符合率基本一致。

4. 协同凝集试验（COA）

业已证实，葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与人及各种哺乳动物IgG的Fc段结合的能力，而不影响抗体Fab段的活性。近年来国内外学者采用抗体致敏的SPA检测细菌即协同凝集试验。如Rahman等用协同凝集试验鉴定霍乱弧菌O1群的初代分离物做快速筛选，比常规法节省时间，对204份材料用两种方法比较表明协同凝集试验具有较高的特异性和敏感性。

5. 酶联免疫测试技术

酶联免疫技术的应用，大大提高了检测的敏感性和特异性，现已广泛地应用在病原微生物的检验。

应用酶联免疫技术制造的mini-Vidas全自动免疫分析仪，是用荧光分析技术通过固相吸附器，用已知抗体来捕捉目标生物体，然后以带荧光的酶联抗体再次结合，经充分冲洗，通过激发光源检测，即能自动读出发光的阳性标本，其优点是检测灵敏度高，速度快，可以在48小时的时间内快速鉴定沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核李斯特菌，空肠弯曲杆菌和葡萄球菌肠毒素等。

三、分子生物学技术在检测食源性病原微生物中的应用

随着分子微生物生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）和聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，业已逐步应用于食源性病原菌的检测。

1. 核酸探针

将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。

2. 核酸探针的类型

根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA 发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA,因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli.选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。

3. 核酸探针的应用

（1）用于检测无法培养，不能用作生化鉴定、不可观察的微生物产物以及缺乏诊断抗原等方面的检测，如肠毒素。

（2）用于检测同食源性感染有关的病毒病，如检测肝炎病毒，流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。

（3）检测细菌内抗药基因。

（4）分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。

（5）细菌分型，包括rRNA分型。

4、核酸探针的特点

4.1 探针的特异性：

探针检测技术的最大优点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。

以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的是基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，它们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。

检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA序列。

另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏能力强，所以用比提取制备蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA.

核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格的条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。

探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增强反应特异性。

4.2 探针的敏感性

研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10-8摩尔特异DNA片段，相当于0.5pg,1000个碱基对的靶系列，相当于1000---10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg,两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng的水平。

延长培养时间，增强信号强度能提高探针的敏感性。

非放射性物标记探针在高浓度情况下，由于抑制了非特异性吸附，比放射性物标记探针背景干扰小。

制备食品样品时，因机械均浆而导致菌体破裂，产生较高的背景干扰会影响检测敏感性。

在探针上加生物素化的核苷酸长尾能使检测敏感性提高10倍。

细胞中rRNA比DNA多，检测rRNA的探针比DNA敏感。通过扩增DNA含量也能提高检测敏感性。

4.3 探针检测技术中存在的问题

检测一种菌就需要制备一种探针，目前尚未建立所有致病菌的探针，尽管检测速度快，但要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养，任何一种方法不可能有100%的特异性和敏感性，所以必须考虑假阳性和假阴性的问题。

DNA探针还不能完全取得常规检验提供的细菌特性的信息，如在菌株生物型鉴定、血清型和抗药基因上有不足之处。

检测食品时，样品中待检菌量低杂质成分复杂，样品DNA纯度不够高等都会限制探针检测的敏感性。

探针检测是分析基因序列，对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测，因为尽管探针能检测活菌或死菌中存在的靶DNA序列，但它不能检测其表达产物，所以在评价食品安全卫生上存在一定的局限性。

5. 核酸探针杂交技术原理

根据完成杂交反应所处介质的不同，分成固相杂交反应和液相杂交反应。固相杂交反应是在固相支持物上完成的杂交反应，如常见的印迹法和菌落杂交法。事先破碎细胞使之释放DNA/RNA然后把裂解获得的DNA/RNA固定在硝基纤维素薄膜上，再加标记探针杂交，依颜色变化确定结果，该法是最原始的探针杂交法容易产生非特异性背景干扰。

液相杂交法指杂交反应在液相中完成，不需固相支持，优点是杂交速度比固相杂交反应速度快5�10倍。缺点是为消除背景干扰必需进行分离以除去加入反应体系中的干扰剂。

分离杂交DNA探针的方法有两种，一种用羟磷灰石，它仅能与双股DNA结合，单股DNA在和羟磷灰石结合前必须先同一个探针或互补单链杂交成双股DNA才可。当溶液中DNA通过羟磷灰石柱子时，只有双股DNA能吸附，然后再把吸附在柱上的DNA洗脱下来，最后用激活的标记物检测。另一种分离方法运用磁球技术把探针与小磁球连接，再用多核苷酸尾部连接第二探针，不用离心就能分离DNA与未杂交DNA.短寡核苷酸能和磁球连接，也能从磁球上洗脱，在以mRNA系统进行靶循环的检测过程中，该方法能将背景干扰降低2---3个数量级，从而达到较高的敏感性。

5.1.夹心杂交法（Sandwish hybridization）

它由三种不同作用的核酸成分组成：（1）：与固相支持物连接的捕获探针；（2）产生信号的检测探针；（3）靶核酸序列。靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能于上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答。

5.2.核酸置换杂交分析法 （Strand displacement assay）

它是在夹心杂交法的基础上改进的一种方法。先奖捕获探针连接在固相物上，然后在此探针上以微弱的结合方式杂交一个短小能产生信号的核酸，如果靶DNA能与捕获探针杂交可通过竞争置换出带信号的核苷酸片段，在检测过程中产生信号的单股核酸可转化为ATP,再加入荧光素酶，用生物发光分析法检测。其优点在于背景干扰小，敏感性强。缺点为不是所有捕获探针都能应用这种方法杂交，且信号探针会不断地从捕获探针上脱落。

5.3.浸染棒法 （Dipstick assay）

它是夹心杂交法最新的一种改进方法。它用两种探针，其中一个进行标记，另一个是单核苷酸长链，如多聚腺苷酸。浸染棒上包裹与多聚腺苷酸长链探针能互补配对的碱基成分，即多聚胸腺嘧啶，尽管杂交反应在溶液中完成，但浸染棒是完成最后检测的固相支持物。它比薄膜法能更有效地减少背景干扰，提高检测效率。亦已用于沙门氏菌和李氏菌的检测。对荧光素标记探针可用辣根过氧化物酶标记荧光素抗体，通过比色法检测复合物浓度。

6. 聚合酶技术（PCR）的原理及其发展

6.1 PCR技术原理

为提高DNA探针的敏感性，可先将靶DNA序列扩增，增加DNA数量，使其达到足够的检测量，若反应以动力学为基础，则能定量分析。1983年Millus 和Cetus发明了最基本的扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法·聚合酶链反应即PCR法。PCR法建立在三步重复发生反应的基础上。①通过热处理将双股DNA变性裂解成单股DNA;②退火延伸引物至特异性寡核苷酸上；③酶促延伸引物与DNA配对合成模板，引物退火，变性DNA片段，引物杂交形成的模板可参与再次反应。溶液中核苷酸通过酶聚合成相互补对的DNA片段，并能重新裂解成单股DNA,成为下次PCR复制的模板。因此每次循环特异性DNA将以双倍量增加。典型扩增经过20�40次循环能引起100万倍的扩增。在PCR反应中引入Taq聚合酶使反应得以半自动化和简便反应程序。用扩增DNA进行的PCR反应具有无与伦比的优越性。如用同位素标记两种基因（Lac Z 和 Lam B）的，探针做PCR反应检测水源中E.Coli,检测量达到1�5 个细菌/100ml.为快速准确的检测食品中污染的病原微生物带来一线曙光。

当然PCR也存在缺点，主要是系统容易受外源DNA的污染，并随样品中待检DNA一起扩增。特别是1990年Bottger发现某些Taq聚合酶被外源性DNA物质污染。另外试验中需要一定的特殊设备和熟练的操作技术，尚不能全自动化，需要花劳力制备待检样品。

6.2 Qβ复制酶法

Gene-Tark改良了PCR方法，建立了Qβ复酶系统扩增法。这种命名是根据反应过程中起扩增作用的酶来确定的。通过探针与靶DNA相结合，系统以酶学方法促进扩增。该探针是含有一个模板区域的RNA探针，其三级结构称作MDV1.系统含有RNA指导的RNA聚合酶、Qβ和复制酶。扩增MDV-1的速度很快。每循环一次需15-20秒，共循环15-30分钟。千分之一含量的RNA可扩增到125-200ng,一亿倍扩增。由于大量合成RNA,用简单的比色法就能检测杂交反应。反应呈动力学特征，建立标准曲线，确定初始结合物浓度，就可做定量分析。缺点是酶易受污染，导致敏感性下降，背景干扰限制了方法的实际应用。

6.3 连续扩增反应法（Lar）

Lar是在PCR基础上的又一种改进，同PCR不同之处在于它不扩增单个核苷酸形成DNA分子，而是用一种称作T4DNA连接酶把两个寡核苷酸彼此相连。通过连接酶的作用，两者能相互交联，在这种情况下，同PCR反应一样，连结的寡核苷酸沿原始系列排列，并成为下次循环的模板。循环20-30次可把原始靶DNA含量增加100万倍。但它需对整个靶DNA序列事先有明确了解，否则一个碱基错配就会导致寡核苷酸相互连结的失败。

6.4.转录放大系统（TAS/3SR/NASBATM）

1989年Kwoh等介绍了一种新技术，转录扩增系统（TAS），它是包括DNA合成和RNA转录的双重循环过程。它以变性DNA和一般RNA为引物的寡核苷酸靶序列，这个寡核苷酸上包含多聚酶结合部和与靶序列互补配对的片段。杂交时，引物与靶序列结合，反转录酶延伸引物与靶序列互相配对，热变性后，另外一个寡核苷酸退火成新股DNA.再加入反转录酶产生与新股DNA互补的双股DNA.并延伸原始的已退火的引物至另外一个靶序列上。加入RNA聚合酶，可以扩增RNA的拷贝数（10-1000）。因此方法仅需4次循环就能得到RNA分子1,000,000个拷贝数。

1990年Gualelli修正了TAS法，设计了一种称作自我片段复制扩增系统（3SR）。3SR与TAS不同之处在于，3SR是等温反应（37°-42°），需要降解RNA靶序列。如果包括最初变性这一步，3SR方法还是需要扩增DNA,RNaseH用于降解在TAS反应中形成的RNA-DNA杂合物，并转化成双股DNA.在双股DNA的每一末端都含有一个聚合酶结合部，双股DNA继续循环并作为合成RNA的模板，再次参加反应过程。15分钟就能放大100,000个拷贝。而PCR法即使有100%扩增效果也需要85分钟才能取得同样结果。